pcv2荧光定量检测方法.pptVIP

Taqman RT-PCR法检测PCV2病毒滴度 养殖企业疫病净化方案设计中心 牟和平 大纲 1 阳性标准品的建立 2 荧光定量条件的优化 3 TCID50与CT值对应关系的建立 阳性标准品的获得 PCV2毒株：DBNSX07 GENBANK登录号：GQ359011 目的基因：ORF2 引物序列： P1:5AGAAGTTATG3 P2:5 TATCCCGTTAC 3‘ 片段大小：457bp 用特异性引物P1，P2 ，以PCV2 疫苗半成品毒株DNA为模板进行PCR扩增，将目的片段切胶回收，然后连接至T -18载体，再转化到DH5α感受态细胞，最后在LA琼脂平板上挑取阳性克隆子，并进行PCR鉴定。 阳性菌液送上海英俊生物公司测序，并进行序列对比，以进一步鉴定含插入片段的重组质粒。 PCR鉴定和测序无误后，用阳性菌液扩大培养并提取质粒，即得到阳性标准品。 最佳退火温度60℃ 阳性标准品片段的扩增与获取 阳性菌落的PCR鉴定结果 测序比较结果1 测序比较结果2 测序比较结果3 荧光定量条件的优化 PCV2荧光定量引物P3,P4的序列： P3：5‘ TATGGCGGAGTTT 3’ P4：5‘ GTGGCTGTTAT 3’ 片段大小：94bp Taqman探针5′端标记的荧