《检验仪器维修与使用》流式细胞分析.pptVIP

第十章 流式细胞分析 主讲：周振华 第一节 流式细胞分析理论知识 什么是流式细胞仪 关键是制备：单细胞悬液。 流式细胞的检测步骤 1、单细胞悬液 2、对测量细胞间隙荧光标记染色 3、流式细胞测量 4、对测量结果进行定量分析 5、对测量结果进行生物医学意义解释 可测量的参数 分为：结构参数和功能参数 1、结构参数：细胞大小、形态、细胞核与细胞质的比值，色素颗粒，亚细胞形态，DNA，RNA，蛋白质含量，细胞表面抗原，碱性蛋白，染色体结构。 2、功能参数：氧化还原酶状态，表面电荷，pH值，膜电位，酶活性，DNA合成能力，膜的流动性，细胞受体，线粒体膜电位，细胞浆和膜的钙离子活性。 影响因素 1、荧光染色 2、激光光源的稳定性 3、细胞流速的稳定性 4、细胞悬液样品的影响 第二节 仪器检测原理 分类： 流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和科研型。 临床型只有分析功能，没有分选功能，操作简便，易学易掌握。 科研型既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来。 流式细胞仪的分类 流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。 前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数。 狭缝扫描流式细胞仪 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液作用：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 长通滤片 短通滤片 带通滤片 （四）细胞分选系统 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。 二、散射光信号和荧光信号的检测 散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片。 侧向散射角(Side Scatter，SSC)：与激光束正交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度正相关。 散射光信号波长与激光相同。 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 荧光信号 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管，光电倍增管将光信号转换成电信号。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。 常用荧光染料 目前台式机FCM配置 488nm激光管常用染料有 PI (Propidium Iodide)碘化丙啶 PE (Phycorey- thrin)藻红蛋白 FITC (Fluorescein Isothiocyanate)异硫氰酸荧光素 PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)叶绿素蛋白 PE-CY5化青素 FCM测量数据的存贮、显示和分析 目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 数据文件为二进制文件，缺乏直观性，数据的显示常用以下几种方式： 直方图 散点图 等高线图 密度图 三维图 直方图 直方图(Distribution Histogram) 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。 散点图 散点图(Dot Plot) X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。 第三节 流式细胞分析应用 一、淋巴细胞亚群分析 二、DNA分析 三、白血病免疫分型和残余白血病检测 四、网织红细胞分析 五、造血干细胞检测 六、器官移植的配型和免疫状态的监控 七、染色体核型分析 淋巴细胞亚群分析 临床意义 淋巴细胞亚群分析 FCM的应用——血液病学 白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 PNH诊断 网织红细胞分析 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析 Flow Tip Laser SS and FL Detector FS Detector 光学系统示意图 细胞悬液形