抗盐、抗寒试验测定方法.docVIP

试验方法1.电解质外渗率(REC)测定参照电导率法[1]，将低温冷冻处理后的枝条剪成2mm的小段，然后称取2g试样投入三角瓶，并加入50ml蒸馏水，浸泡24h后，测定浸出液的电导率(重复三次)。然后放在水浴锅中煮沸1h，静止冷却后测定其电导度。相对电解质渗出率Y(%)=初电导值/终电导值×100。2.可溶性蛋白测定参照考马斯亮蓝G-250染色法[2]，称取0.1g枝条，加5ml蒸馏水研磨，洗液并入5ml离心管中，加盖。在4000r.min-1离心10min，然后吸取上清液放入10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。取提取液1ml，加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液，混合，放置2min。以空白作参比，在595nm下比色，测定吸光度。计算公式为：样品蛋白质的含量（mg.g-1）=C×VT/VS×FW×1000。式中C为查标准曲线（μl）；VT为提取液总体积(ml)；VS为测定时加样量的体积（ml）FW为样品重量（g）。3.可溶性糖测定 参照蒽酮比色法[2]，称取0.1g枝条，加5ml蒸馏水，洗液并入25ml具塞试管中，加盖，于沸水中提取30min，提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗，定容至刻度。吸取样品提取液0.5ml，加3ml蒸馏水，0.5ml蒽酮乙酸乙酯和5ml浓硫酸充分振荡，放入沸水浴保温1min，自然冷却后，以空白作参比，在630nm波长下比色，测定吸光度。计算公式为：可溶性糖含量（%）=(C×V/a×n)/(W×106)×100。式中C为标准方程求得糖量（μg）；a为吸取样品液体积（ml）；n为稀释倍数；V为提取液体积（ml）；Ｗ为样品重量（g）。4.游离脯氨酸测定参照酸性茚三酮染色法[3]，准确称取0.3g剪碎的枝条，加入5ml3%磺基水杨酸溶液，在沸水中提取10min（提取过程中要经常摇动）。待冷却后，吸取2ml提取液，加2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮，加热30min。冷却后加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻。吸取各管上层的脯氨酸甲苯溶液，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。计算公式为：脯氨酸（μg/g）=（C×V/a）/w。式中C为提取液中脯氨酸浓度（μg），由标准曲线求得；V为提取液总体积（ml）；a为测定时吸收的体积（ml）；W为样品重量（g）。5.丙二醛（MDA）含量测定参照硫代巴比妥酸(TBA)法[3]，称取剪碎的枝条0.1g，加入2ml10%TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加3mlTCA进一步研磨，匀浆转移到5ml离心管中，在4000r/min离心10min。吸取上清液2ml，加入2ml0.6%TBA溶液，混匀，于沸水浴上反应15min,迅速冷却，离心。取上清液在532、600和450nm波长下测定光密度。计算公式为：MDA（μmol/gFW）=MDA浓度（μmol/L）×提取液体积（mL）/植物组织鲜重（g）×103。POD测定 POD测定参照李合生的试验方法[4]。称取枝条0.1g于预冷的研钵中，加2ml预冷的50mmol/lPH7.8磷酸缓冲液(内含1%PVP)在冰浴下研磨成匀浆，加入至研钵中50mmol/lPH7.8磷酸缓冲液冲洗研钵2~3次，并使终体积为5ml，并匀浆液于4℃下10000rpm离心15min，上清液即为POD 酶液。取酶上清液1ml至15ml具塞试管中，加入0.1%愈创木酚1ml摇匀后再加入蒸馏水6.9ml，摇匀，最后加入0.18%H2O21ml,立即计时，并摇匀。25℃下准确反应10min，加入5%偏磷酸0.2ml,终止反应，以不加H2O2的空白管调零在470nm下比色。计算公式：POD活性（ug.gFW-1）=X/FW(g)，式中，FW为样品重量、X为回归方程计算出4-邻甲氨基苯酚的含量（ug/ml）7.SOD含量测定 SOD测定参照李合生的试验方法[4]。酶液提取：称取枝条0.1g于预冷的研钵中，加2ml预冷的50mmol/lPH7.8磷酸缓冲液(内含1%PVP)在冰浴下研磨成匀浆，加入至研钵中50mmol/lPH7.8磷酸缓冲液冲洗研钵2~3次，并使终体积为5ml，并匀浆液于4℃下10000rpm离心15min，上清液即为SOD 酶液。显色反应：取透明度好、质地相同的试管4支，2支为测定、2支为对照，加1.5ml 50mmol/l磷酸缓冲液，0.5ml蒸馏水，0.3ml 130mmol/lMet溶液，0.3ml 750umol/lNBT溶液，0.3ml 100umol/lEDTA-Na2溶液，30ul酶液（对照加30ul蒸馏水），0.3ml 20umol/l核黄素，混匀后，给一个对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其它各管同时置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管照光情况一致，反应温度控制在25~35℃之间，视酶活性高低适当调整