不作为常规克隆载体和增殖-西北师范大学.PPTVIP

第五章、噬菌体和粘粒载体 第一节 噬菌体的一般生物学特性   第二节 λ噬菌体载体 5.2.2 λ噬菌体DNA的复制 5.2.3 λ噬茵体载体的构建及其主要类型 （2）筛选失去固有EcoRI 位点的λ突变体的办法 凯伦噬菌体载体 5.2.4 λ噬茵体载体的改良 Spi-正选择的λ噬菌体载体 具有体内删除特性的λ噬菌体载体---λZAP载体 λZAP载体的主要特点 5.2.5 λ重组体 DNA分子的体外包装 5.2.5 λ噬菌体 DNA的包装限制问题 5.2.6 λ 重组分子的选择方法 5.2.7 克隆在噬菌体载体上的外源基因的表达 第三节 柯斯质粒载体 第四节 单链丝状噬菌体载体 5.4.1 特点 5.4.3 M13噬菌体载体 5.4.4 噬菌体展示载体 第五节 噬菌粒载体 噬菌粒载体的优点 （1）小分子量、拷贝数高的cccDNA，可克隆高达10 kb的外源DNA； （2）有ampr 等基因作为选择记号； （3）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制； （4）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。 （5）可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。 噬菌粒体外转录载体 第六节 人工染色体载体 第一，核酸内切酶消化载体，除去可取代的DNA区段。 第二，λ DNA臂同外源 DNA片段连接。 第三，重组体的 DNA分子进行包装和增殖，得到有感染性的λ重组噬菌体。 用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤： 返回第五章 改良λ噬菌体载体的首要目的在于增加容纳能力。 除此之外，改良工作还围绕着如下三个主要目的进行： 设计可对重组分子正选择的λ噬菌体载体 可转录重组DNA以制备其RNA探针 使重组cDNA与LacZ融合形成融合蛋白 返回第五章 一批经过改良的λ载体的一个共同特点是，在中心限制片段上具有λ的两个基因：red和gam(决定 sensitive to P2 inhibition，即λ不能够在P2噬菌体溶源性细菌中生长）。 red gam 野生型：表型为Spi＋ 突变型：表型为SPi一，能够在噬菌体P2溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌斑。 返回第五章 应用λ载体获得了阳性噬菌班后，必须对克隆的基因进行鉴定，而且大分子量的λ载体在限制图的构建及基因序列测定方面都是相当麻烦的。因此，以往是在分离到了含有目的基因的λ载体之后，先把插入其中的外源DNA片段亚克隆到质粒载体上，再进行各项有关的分析。这是一种相当烦琐的过程。 能否发展出一种可将插入的DNA片段直接从λ载体转移到质粒载体的快速简便的体内系统呢？ 返回第五章 λZAP本质上是插入型载体。基因组中含有一个可以在体内发生删除作用的pBluescript噬菌粒（见本章第五节）的DNA片段，两侧是由两个单链DNA噬菌体fi的复制信号。 pBluescript SK (+/-) 2958 bp 重组λZAP载体感染细胞后，再用辅助噬菌体M13（或fi）超感染。 返回第五章 ①单个酶的单识别位点，可以克隆10kb大小的外源DNA片段； ②能从lacZ启动子表达lacZ/外源DNA的融合蛋白质，并可用抗体筛选； ③lacZ基因部位有单克隆位点，可在Xgal显色反应平板上筛选； ④克隆的外源DNA片段，可在体内自动地从载体上随pBluescriptSK（一）一道删除下来，置于较小型的噬菌粒载体上，便于进行限制图的构建和 DNA核酸序列的测定。 ⑤利用T3或T7噬菌体的RNA聚合酶，可方便地制备外源DNA插入序列的RNA转录本，制备RNA探针。 返回第五章 由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染（transfection），它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导（transduction）。 转染本质上同质粒 DNA的转化作用,但转染是一种低效的过程。 即便是使用未经任何处理的新鲜λDNA，典型的转染效率（即每微克 DNA转染产生的噬菌班数目），也仅为 105～106之间。 返回第五章 应用体外包装技术，把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒，从而能够按照正常的噬菌体感染过程导入寄主细胞，明显地提高λ重组体DNA分子转染效率。 所谓λ DNA的体外包装作用，就是要在体外试管中，完成上述发生于寄主细胞内的全部包装过程。 返回第五章 返回第五章 噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％~75％。这就是λ噬菌体的包装限制。 野生λ DNA分子长度为 48kb计算，其包装上限是 kb。 野生λ DNA中必要基因28kb，因此载体克隆外源DNA的理论极限值应是 kb。 替换型载体中的可取代片段，超