pcr引物设计引物决定了pcr产物的长度和特异性-生物化学与分子.ppt

模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋DNA，如基因组DNA，及闭环双链DNA，如质粒； 模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组DNA、提取mRNA经反转录得到cDNA、质粒、病毒等； 每个反应中模板的量为1 ng～1 μg。质粒DNA和纯化的DNA的量可少一些，而基因组DNA的量应多一些。 PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致PCR的非特异性扩增。 1、模板DNA 引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为5′端引物和3’端引物，或称为正向引物和反向引物。 通常DNA及mRNA序列的写法为5′→3′，所以5′端引物与目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物与目的序列的3′末端序列反向互补。 2、引物 它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有15～18 bp。 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 上游引物 下游引物 DNA聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。 早期的PCR反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。 随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使P