凝胶过滤层纯化细胞色素C.pptVIP

实验七 凝胶过滤层析纯化细胞色素C 一、目的要求 1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯化 二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 内水体积Vi 外水体积Vo 柱床体积Vt 洗脱体积Ve Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi Kd=0 Kd=1 0Kd1 Kd1 优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 凝胶及柱的选择 样品上柱 分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定 三、试剂与器材 试剂：0.01mol/l Tris-HCl缓冲液，PH7.5，含0.2mol/l NaCl 器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪 、记录仪 四、仪器的使用－