流式细胞术样本制备ppt课件.ppt

本次实验课流程;流式样本制备;流式在细胞表面分子检测中的应用;标本来源;; 标本制备;标本制备;四、贴壁细胞单细胞悬液的制备 （1）将培养细胞用0.04％EDTA或0.25％胰酶消化3～7分钟， 至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化 液，加PBS； （2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中； （3）离心，1000r/min，5min； （4）加PBS洗两遍； （5）PBS重悬，将细胞吹打均匀； （6）荧光标记。;标记方法;对照设置;同型对照（Isotype Control）;双色标记荧光补偿;荧光补偿对照;注意事项;样本的采集;样本的储存;样本的染色; 溶血，即裂解红细胞。它是流式细胞术分析白细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好分开，溶血好坏直接影响检测结果。因此，必须对溶血过程进行严格控制。 ;;结语;常用的荧光染料;参考书籍;实验：人外周血T淋巴细胞亚群的 检测与分析;淋巴细胞;T淋巴细胞(CD3+);活化T淋巴细胞; 实验分组;1.取4只FCM测量管，编号blank、CD3、CD4、CD3\CD4，各管内加入100μl新鲜抗凝血； 2.直接标记法：各管内加入相应的荧光标记抗人的单克隆抗体 2ul，充分混匀，闭光孵育20～30min； 3.溶血。ACK溶血剂:加入500μl ACK溶血剂，充分混匀，反应10min, 1500r/min离心5min，去上清，PBS洗1次；若红细胞存留较多，再重复溶血一遍。收集细胞上机检测。;ABC溶血剂配方;ACK溶血剂配方;荧光补偿;“A门”内CD3/CD4的表达;“A门”位置变化引起的改变;“A门”位置变化引起的改变;;小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达;流式检测胞内细胞因子步骤 ;6、 溶血。各管内加入1ml BD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。 7、 固定。各管内加入500μl 2%PFA固定剂，4℃避光固定30min。1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗两次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。 8、 透膜。各管内加入500μl 透膜液，4℃避光10～15min。1800rpm*5min离心去上清。 9、 封闭。6、7号管加入25μl封闭液。（5μl小鼠血清+20μl 10%BSA)4℃避光30min。 10、 胞内染色。6号管内加入同型对照抗体FITC-mIgG1和PE-mIgG1各2μl； 7号管内加入抗体FITC-IFNg和PE-IL17各5ul。4℃避光染色30min后透膜液500μl/管洗一次,SB染色缓冲液 1ml/管再洗一次。 11、上机检测。2%PFA固定剂300μl/管混匀重悬4℃放置待检。;;流式检测外周血Treg细胞步骤;3、溶血。 各管内加入1ml BD溶血剂，混匀，室温避光静置10min，1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗一次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。 4、固定。各管内加入500μl 2%PFA固定剂，4℃避光固定30min。1500rpm*5min离心去上清。SB染色缓冲液1ml/管洗两次，1500rpm*5min离心去上清，混匀沉淀细胞。 5、透膜。各管内加入500μl 透膜液，4℃避光10～15min。1800rpm*5min离心去上清。 6、封闭。7、8号管内加入25μl封闭液。（5μl小鼠血清+20μl 10%BSA)4℃避光30min。 7、胞内染色。7号管内加入同型对照抗体APC-mIgG2a 2μl； 8号管内加入抗体APC-Foxp3 2ul。4℃避光染色30min后透膜液500μl/管洗一次,SB染色缓冲液 1ml/管再洗一次。 8、上机检测。2%PFA固定剂300μl/管混匀重悬4℃放置待检。;;溶液配方;思考题、实验报告;