人工染色体载体ppt课件.pptVIP

第四章　人工染色体载体;利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。;目前常用的人造染色体载体包括： ;pHC79;第一节　 黏粒（cosmid）载体;考斯质粒（cosmid）= 质粒+ cos序列。 　　;黏粒它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA。克隆的最大 DNA 片段可达45kb。 ①质粒复制起点（colE1） 象质粒一样转化和增殖。 ②抗性标记Ampr 。 ③ cos位点。有的粘粒载体含有2个cos位点。;一、黏粒的结构特征和用途;二、 构建cosmid克隆载体的策略;由λDNA片段和pBR322质粒DNA联合组成的。;pBR322质粒(p43);　　用λ噬菌体基因组的cro—rⅡ的BglⅡ限制片段，取代pBR322质粒DNA的位于1 459～1 666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ单切割位点的重组体分子。;　　λDNA片段除了cos位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列；;三、 cosmid克隆载体的特征;　　cosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，同样也会获得扩增。;③具有λ噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一个cos位点。 ;　　进入寄主细胞之后的cosmid克隆载体DNA分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起来。;④构建的cosmid克隆载体较小，因此能承载比较大的外源DNA片段。 ;四、cosmid克隆载体的工作原理;　　因为cosmid克隆载体含有cos位点，可承载大的DNA片段，进行体外包装后能高效率转导受体细胞 。　;　　作为λ噬菌体克隆载体，线形重组λDNA分子两端必须各有一个cos末端。而cosmid克隆载体只有一个cos位点，因此必须先对cosmid克隆载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二联体线形DNA分子。;　　当外源DNA片段组入二联体线形DNA分子，并且两个cos位点之间的DNA核苷酸序列达到足够长时，两个cos位点可被A蛋白切割，产生具有两个cos末端的重组λDNA分子，就能进行有效的体外包装。 ;使用cosmid克隆载体的基本程序是： ;Date;Date;　　不管是(a)程序还是(b)程序，最后获得的重组线形DNA分子必须保留质粒的复制起始位点(ori)和选择标记基因，保证重组的线形DNA分子导入受体细胞后，cos末端自行连接环化，按质粒的性质进行自主复制，并???有效地表达选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。;五、 cosmid克隆载体（自学P72）;六、 构建cosmid文库应注意哪些问题; ②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度； ; ③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。 　 现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。;Date;pYAC4;pYAC4;pYAC4;这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制。 这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。;　　　筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记； 　　筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。;人工酵母染色体克隆载体的构建;pYAC4;　　此克隆载体的sup4(抑制基因：抑制赭色表型 )基因上，组装了供插入外源DNA片段的克隆位。;主要结构： ①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； ②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； ③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构；;⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增； ⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点； ⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。 ;克隆载体pYAC4;　　首先用EcoRI和BamHI双酶切割，获得均具BamHI和EcoRI切割末端的两个DNA片段(双臂)，随后把两端具EcoRI切割末端的外源DNA与此双