南开大学硕士的环境分子生物学实验的报告.docxVIP

2012年环境分子生物学实验报告实验一：16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群一、实验原理由于微生物体内16S核糖体RNA的基因编码区含有一定的保守序列和非保守序列，保守序列可应用与PCR引物的设计，非保守序列则可应用于不同种类微生物间的比较鉴定。双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的 DNA 片段能够被区分开，但同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。试验首先提取水样样品的DNA，用根据实验目的设计的引物进行PCR扩增，PCR产物用DGGE等方法分析，借此评估土壤微生物遗传物质多样性。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的 PCR 由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA 置高温下（通常为 93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’到3’方向延伸，合成DNA 的新互补链。DGGE可以根据序列将相同长度的DNA片段混合物分开。分离的原理是基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配制的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性熔点不同实现的。在5’端引入GC夹（GC-clamp）可以保护DNA片段不会完全变性。DGGE能对微生物群落进行快速的分析和比较。利用DGGE可使组成的多样性一目了然，不同序列的片段将停留在不同的位置，其中每一条带原则上代表一种细菌系群。染色后，在凝胶中DNA分子停止迁移的位置会看到条带。理论上，DGGE指纹图谱可以区分不长于500bp的PCR扩增产物上的一个碱基对的差别。该技术在快速比较不同环境中的微生物群落和监测某一特定的群落在不同时间的组成变化中非常有效。二、设备与仪器PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统，高速冷冻离心机，台式离心机，移液枪及枪头，离心管等。三、实验步骤1、地表水细菌基因组DNA提取1）实验试剂①裂解液：0.05 M Tris-HCl（pH 8.0），0.1 M NaCl，0.1 M EDTA（pH 8.0），1% SDS；②Tris饱和酚：用1M Tris-HCl（pH 8.0）饱和的新鲜苯酚，含0.1%的8-羟基喹啉，pH＞7.8；③酚/氯仿/异戊醇：Tris饱和酚中加入氯仿和异戊醇，体积比为25:24:1；④TE：0.01M Tris-HCl，0.001M EDTA，pH8.0;⑤1×TAE电泳缓冲液：0.04 M Tris，0.02 M HAc，0.05M EDTA，pH8.0;⑥0.5×TBE电泳缓冲液;⑦无水乙醇，70%乙醇。2）实验步骤①取1.5mL地表水样4000r/min离心10min，弃上清。重复六次后，加入500μL裂解液充分悬浮。②加入500μL Tris饱和酚，混匀，室温放置10min，4000r/min离心10min。③吸取上层水相转移至新离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀后4000r/min离心10min。（若有必要，可重复操作一次。）④吸取上层水相转移至新离心管，加入两倍体积无水乙醇，充分沉淀后10000r/min离心10min，弃去上清液。⑤加入1mL 70%乙醇，充分悬浮后10000r/min离心10min，弃去上清液，晾干10min。加入50μL TE溶解，得到细菌基因组DNA。⑥取10μL样品进行电泳检查（Marker为λDNA/HindⅢ酶切），剩余样品-20℃保存。2、细菌16S rRNA基因V3区扩增取2.0 μL基因组DNA作为PCR模板，按照下表顺序和体积将反应液加入0.5mL的薄壁PCR管中，总体积50μL。引物1：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’引物2：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’表：试剂体积(μL)终浓度模板2.0--引物1 (10 μM)1.00.2 μM引物2 (10 μM)1.00.2 μM10×PCR Buffer（含Mg2+）5.01×10 mM dNTPs1.00.2 mMTaq聚合酶1.02 Udd H2O39.0--总体积50.0--轻轻混匀并瞬间离心，放入PCR仪进行扩增，共35个循环。PCR反应条件：94℃，5min，预变性；94℃，