合成基因产物的体系真核表达系统.PPT

食品生物技术精品课程 主讲：刘常金 第三章 蛋白质改造的分子途径及其蛋白质的异源表达 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。 位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。 PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。 1．寡核苷酸介导的位点特异性突变 这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，也称为专一性位点突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 (1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于DNA模板的制备 寡核苷酸突变引物的设计和选择 寡核苷酸突变引物与DNA模板的退火和引物延伸条件 DNA聚合酶的选择 存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响 受体细胞对突变体产率的影响 关于DNA模板的制备 双链DNA模板：质粒 单链DNA模板：M13噬菌体载体，足够纯净(避免RNA污染) ② 寡核苷酸突变引物的设计和选择 引物特征： 具有和模板DNA的互补区； 足够长，能与目标DNA序列退火； 突变引物应尽可能避免形成稳定二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列； 突变引物不能与目标DNA的其它区域和载体DNA形成稳定的杂交体。 引物设计取决于所要产生的突变类型： 用于单个核苷酸改变的引物，一般长度为17－19个核苷酸； 多处改变核苷酸或改变2个以上，一般长度为25个核苷酸以上。 寡核苷酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件 退火条件： 突变引物与模板DNA的摩尔比为10－50；退火通常将二者混合物加热到Tm值以上20度，然后再缓慢冷却到室温；对于A＋T含量高的引物，为保证退火安全，加热后可冷却到较低温度，以稳定模板和引物复合体。 引物延伸条件： 退火完成后加入4种脱氧核苷三磷酸，DNA聚合酶、DNA连接酶等，进行2-15小时的延伸反应。 DNA聚合酶的选择 目前一般选择T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶 ⑤ 存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响 dCTP氧化脱氨可产生微量dUTP， dUTP渗入到新生DNA链中后，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切断DNA链，降低突变体的产率。 利用经HPLC纯化的高质量的dNTP可以降低U碱基的错误搀入，提高突变产生的比率。 ⑥ 受体细胞对突变体产率的影响 受体菌中的错配修复系统将产生的突变去除； 当用M13作为克隆载体时，由于M13 DNA可能出现不对称复制，如果突变链的复制效率较低，则最终将降低突变体的产率。 为了提高突变体的回收率，即提高突变效率，利用点错配修复缺失的菌株为受体菌可使突变产率提高近10倍。 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 2．区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。 盒式突变的具体操作是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。 盒式突变的两个关键问题： 目标基因中要有适当的限制性内切酶识别位点。对于天然蛋白质来说，其所含可供利用的限制性内切酶识别位点很少，可利用遗传密码的简并性在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限制性内切酶位点，便于盒式突变的操作。 用于取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段的获得。目前利用PCR技术可产生具有特定限制性内切酶位点的、具有各种突变位点的盒式突变DNA片段的技术已经很成熟。 第三节