酶促反应动力学实验6.pptVIP

实 验 二 酶促反应动力学实验 实 验 原 理 1、酶促反应的特性：高效性、高特异性、高不稳定性、可调节性。 反应体系的条件必须严格控制。 2、酶活性测定的基础是化学反应速度的比较，即酶催化的化学反应速度与无酶或酶失活情况下化学反应速度的比较。 反应速度通常以测定单位时间内产物生成量或底物的减少量来确定。 3、酶催化反应的典型曲线是随着时间的延长，反应速度下降，由起初的直线变为曲线。 测定酶活性的所有反应速率的比较都必须依赖该曲线的线性部分，因此要测定最初反应速度，即底物浓度变化在底物起始浓度的5％以内的速度。 4、实验对象：碱性磷酸酶（AKP） 磷酸苯二钠 一、pH对酶促反应速度的影响 碱性磷酸酶（AKP）的最适pH值是10。 二、温度对酶促反应速度的影响 碱性磷酸酶（AKP）的最适温度是37℃。 三、底物浓度对酶促反应速度的影响——碱性磷酸酶米氏常数的测定 Lineweaver-bulk（林－贝氏方程）方程： 操作： 2、另取试管9支，做酶促反应： 酶活性计算及Km值求取 1、在37°C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。 2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。 四、抑制剂对酶促反应的影响 非竞争性抑制 操作 1、不同浓度基质液的配制： 酶活性计算及Km值求取 1、在37°C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），以此计算处各管的酶活性（v）。 2、以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值，并判断该抑制剂属于何种类型。 注意事项： 配制的各种试剂及反应液必须混匀。 加酶液要准确快速，以保证各管酶促反应同时开始。 加入酶液后要立即计时，计时要准确。 0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5％ 铁氰化钾 2.0 ml要依次加入，充分混匀，放置10分钟，放置时间不可过长。 * * [S] V Vmax 碱性磷酸酶 苯酚＋磷酸氢二钠 4-氨基安替比林 ＋ K3Fe（CN）6 醌衍生物（红色） 碱性条件 Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ ── 米-曼氏（Michaelis-Menten）方程： Vmax V [S] Km Vmax/2 + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 1/[S] 1/V -Km Km/Vm 1、不同浓度基质液的配制： 试剂 管号 0 2 2 3 4 5 6 7 3 蒸馏水（ml） 3 2 1 1 1 1 1 1 0 0.01 mol/L基质液（ml） （9） （8） （7） （6） （5） （4） （3） （2） （1） 混匀。 试剂 管号 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 pH10碳酸钠缓冲液（ml） （9） （8） （7） （6） （5） （4） （3） （2） （1） 吸取上表稀释基质液1ml 9 8 7 6 5 4 3 2 1 混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。 10/2 10/4 10/6 10/8 10/10 10/12 10/14 10/16 0 pH10碳酸钠缓冲液（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 酶液（ml） 加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 ℃准确保温15分钟。 3、保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。 4、各管分别加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5％ 铁氰化钾 2.0 ml，充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。 1/S 1/v v A Km＝？ 抑制剂↑ 无抑制剂 1/V 1/[S] 竞争性抑制作用 抑制剂↑ 1 / V 1/[S] 无抑制剂 抑制剂↑ 1/V 1/[S] 无抑制剂 反竞争性抑制 实验所用的抑制剂是磷酸氢二钠。 试剂 管号 0 2 2 3 4 5 6 7 3 蒸馏水（ml） 3 2 1 1 1 1 1 1 0 0.01 mol/L基质液（ml） （9） （8） （7） （6） （5） （4） （3） （2） （1） 混匀。 2、另取试管9支，做酶促反应： 试剂 管号 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 pH10碳酸钠缓冲液（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.