人胆囊癌干细胞的分离 鉴定及其恶性生物学行为的调控研究-isolation and identification of human gallbladder cancer stem cells and their regulation of malignant biological behaviors.docx

人胆囊癌干细胞的分离、鉴定及其恶性生物学行为的调控研究华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科博士研究生:石程剑导师:秦仁义教授中文摘要第一部分体外无血清培养胆囊癌悬浮细胞球及其生物学特性研究目的：通过体外培养扩增胆囊癌悬浮细胞球并分析其生物学特性，明确其中是否富含有肿瘤干细胞，并初步筛选其细胞表面标志物。方法：将人原代胆囊癌组织和胆囊癌细胞系GBC-SD消化制成单细胞悬液，置入含有多种细胞因子的无血清培养液DMEM／F12中培养出肿瘤细胞克隆球；将培养出肿瘤细胞克隆球给予传代扩增；并将其置入含有血清的分化环境中贴壁培养，14天后实时定量RT-PCR检测干细胞标记物Oct-4和Nestin的表达；MTT法检测克隆球细胞和贴壁细胞的增殖能力和对化疗药的敏感性，并植入裸鼠皮下比较移植瘤形成能力；用流式细胞术法检测肿瘤干细胞标志物CD24、CD44、CD133在克隆球细胞和贴壁细胞中的表达。结果：人原代胆囊癌细胞和GBC-SD细胞均可在干细胞培养环境中长出克隆球，并可以连续传代形成新的克隆球；克隆球细胞在含血清的环境中出现贴壁生长并分散开，克隆球渐变小最后消失，同时干细胞标记物Oct-4和Nestin的表达下调；与贴壁细胞相比，克隆球细胞在体外具有强的增殖、耐受吉西他滨和5-氟尿嘧啶和在裸鼠皮下形成新的移植瘤能力；经流式细胞术检测，CD133+细胞在克隆球细胞中的比例高于在贴壁细胞中的比例。结论：人原代胆囊癌细胞和GBC-SD细胞中存在肿瘤干细胞，可以通过在干细胞培养条件下培养得到一定程度的扩增，CD133蛋白可能为其细胞表面标志物。关键词：胆囊癌，肿瘤干细胞，无血清培养基，细胞表面标志物，CD133蛋白。第二部分胆囊癌干细胞的分离及生物学特性鉴定目的：用细胞表面标志物CD24、CD44、CD133分离出胆囊癌亚群细胞并进行肿瘤干细胞特性分析，鉴定出胆囊癌干细胞样细胞。方法：将新鲜的人胆囊癌组织标本切成小块后置入裸鼠皮下建立裸鼠荷瘤模型，为下一步研究提供胆囊癌标本材料；将胆囊癌组织和GBC-SD细胞制成单细胞悬液后，标上抗人CD24-FITC、CD44-APC和CD133-PE流式抗体，流式细胞术检测并分离出CD24+、CD44+和CD133+细胞，进一步研究各亚群的生物学特性；将具有肿瘤干细胞特性的亚群标志物联合检测、分选亚群细胞及研究生物学特性包括在无血清培养环境中克隆形成球、对化疗药吉西他滨和5-氟尿嘧啶的敏感性、在NOD/SCID鼠体内形成异种移植瘤能力及体内自我更新、分化潜能。结果：新鲜的人胆囊癌组织标本植入裸鼠皮下3～6月后大部分裸鼠成功长出移植瘤；经流式分析CD24+、CD44+和CD133+细胞在原代胆囊癌和GBC-SD细胞中的比例分别为：20.83%~35.72%和55.73%，78.19%~93.36%和96.78%，1.93%~3.43%和61.28%；经生物学特性研究，CD24+和CD24－细胞在形成克隆球、移植瘤形成能力上没有明显差别，差异性没有统计学意义（P0.05），而CD44+和CD133+细胞在形成克隆球、移植瘤形成能力上均明显强于相应的阴性亚群（P0.05）；流式进一步检测观察到CD44＋CD133＋细胞在原代肿瘤和GBC-SD细胞中的比例为2.53%和60.62%，且CD44＋CD133＋细胞较CD44＋CD133－细胞具有更强的形成克隆球、耐受化疗和移植瘤形成能力；经流式分析和免疫组化检测CD44＋CD133＋细胞形成的移植瘤细胞中，既有CD44+和CD133+细胞，也含有CD44－和CD133－细胞。结论：人胆囊癌CD44＋CD133＋细胞具有肿瘤干细胞的特性，其中富集有肿瘤干细胞，CD44和CD133可用来分离胆囊干细胞。关键词：胆囊癌，肿瘤干细胞，细胞表面标志物,CD44蛋白，CD133蛋白，生物学特性。第三部分CD133特异siRNA对胆囊癌细胞生物学行为的影响及核转录因子Gli在胆囊癌细胞中的表达目的：通过运用RNAi干扰技术沉默胆囊癌细胞株GBC-SD的CD133的表达，研究其对GBC-SD细胞的生物学行为的影响，研究核转录因子Gli在胆囊癌细胞中的表达。方法：将CD133特异性siRNA转染胆囊癌细胞株GBC-SD，并运用Westernblot和流式细胞术分析并优化转染的效率和效果；在无血清环境中检测其克隆球形成能力，运用MTT分析其体外增殖和对5-氟尿嘧啶的耐受性，以细胞划痕实验检测其细胞迁徙能力；运用实时定量RT-PCR检测核转录因子Gli1、Gli2、Gli3在胆囊癌不同亚群中的表达。结果：特异性siRNA转染后，经Westernblot和流式细胞术分析,胆囊癌细胞株GBC-SD的CD133表达明显下调；转染CD133特异性siRNA组细胞较空白对照组和转染非特异性siR