禽流感免疫胶体金快速检测技术研究ppt课件.pptVIP

禽流感免疫胶体金快速检测技术研究;研究的背景和意义 AI爆发时来势凶猛，新型毒株的出现和致病力的增强等特点始终威胁着畜牧业和人类健康，对禽流感进行实时监测已成为畜禽疾病检测的重要内容。禽流感的检测方法虽然已有较多报道，但多数方法需要特殊的仪器设备，且在灵敏性、特异性等方面存在不同差异，多数方法只能在实验室中完成。因此急需建立一种适合基层使用的禽流感快速检测方法。 免疫胶体金层析法是将免疫胶体金技术与层析分析技术有机结合起来的一种快速免疫学检测技术。近几年该技术已经引起兽医界的重视，猪瘟免疫抗体、口蹄疫抗体、猪伪狂犬病抗体快速检测及鸡传染性法氏囊快速诊断等均有用相关免疫胶体金层析测试条进行快速检测的试验。 禽流感免疫胶体金测试条可在十几分钟内实现对禽流感的快速检测，该测试条在国外已有生产，我国还未见有相关研究的报道。本试验将免疫胶体金诊断技术用于AIV的检测，该方法的确立将为实现临床快速、准确诊断禽流感提供有效检测方法。 ;研究内容;;试验一 抗AIV McAb的研制; 标准禽流感抗原经葡聚糖凝胶 Sephadex G-200柱层析，分次收集并测定各管蛋白含量，经过0.01mol/L PBS（pH为7.4）洗脱，所得的洗脱峰如图。;收集61—78号管内样品，用国外标准禽流感胶体金试纸条初步鉴定结果如图 。; AIV 10％ SDS—PAGE鉴定结果 ;间接ELISA抗原与抗体的工作浓度的确定;融合前后细胞形态观查 ; 细胞融合及筛选;McAb的Ig亚型鉴定试纸条的G1，κ区各出现一条清晰的条带，表明单抗的亚型属IgG1, κ型。 ;McAb的提纯 ;  McAb交叉间接ELISA试验结果 ;小结 ;试验二 禽流感免疫胶体金层析法的建立; ;不同胶体金颗粒标记抗体效果如表所示，40 nm的胶体金很不稳定，制备起来很困难，容易产生沉淀，20 nm的胶体金灵敏度较差；30 nm的胶体金稳定性、灵敏度均较好。;抗体最适稳定量 ;;;样品垫处理液的选择;金标抗???、羊抗AIV IgG 、羊抗鼠IgG喷涂量的确定; 7号效果最好，当稀释100后OD520＝0.62的金标抗体喷量为2.0 μl/cm，羊抗AIV IgG(5.0mg/ml)喷量0.75 μl/cm，羊抗鼠IgG (8mg/ml)喷量为1.0μl/cm时检测线、质控线最为清晰。 ;测试方法与评判 取待检样品50 ul，滴于测试条的加样区；待测样品按如图所示的方向，通过层析作用，从加样区经过检测线、质控线，最后到达吸附区。反应经过10-15 min即可判定结果。;AIV检测的评判标准 ;稳定性试验 ;小结 ;试验三AIV免疫胶体金层析法与夹心ELISA法的比较;夹心ELISA法的程序表;Ab1、Ab2最佳工作浓度的选择的确定 ;灵敏度试验 ;对不同稀释浓度的AIV标准抗原进行检测，重复检测16次，浓度在7.5ng/ml-500ng/ml的结果为阳性。在7.5ng/ml与3.75ng/ml之间设7ng/ml、6.5ng/ml、6.0ng/ml、5.5ng/ml、 5ng/ml、 4.5ng/ml、4.0ng/ml几个浓度度，再次进行检测，当抗原浓度为5ug/ml时检测线反应结果较明现，抗原浓度为4.5ng/ml时反应结果不明显。初步判定AIV免疫胶体金层析法检测的灵敏度为5ng/ml。;特异性试验 ;准确度试验 ;精确度试验 ;小结 ;全文总结 ;谢谢！