年公共卫生硕士课件.ppt

2. 人乳腺癌细胞系筛选法 EPA选取了几种不同的人乳腺癌细胞系，构建了可以产生雌激素受体的T47D细胞系、可以产生雄激素受体的 MDA453细胞系和可以产生甲状腺激素受体的HeLa细胞系， 以它们产生的反应受体应用于快速筛选EDCs，该方法可进行大量样品的初步检测，省时省力。 而且，由于受体应答反应的差异，可以有效区分开激素激动剂和激素拮抗剂。 （三）细胞筛选法 1. 细胞增生实验 目前最常用的是的E - screen 试验，又称人乳癌细胞(MCF-7) 增生实验。MCF - 7是激素依赖性细胞系，雌激素可诱导该细胞的细胞增生。E - screen试验的基本方法是用活性炭-葡聚糖处理实验动物血清，以去除内源性雌激素，而后比较在含有10%处理后血清的培养液中，加和不加雌激素以及不同浓度的类雌激素物质培养后的细胞数量。 2. 酵母筛选测试法 酵母筛选实验的基本方法是利用分子生物学技术将激素效应元件的基因序列插入报告基因的上游，将报告基因置于基因重组酵母细胞激素受体的调控之下。当EDCs作用于酵母细胞时，会使特定的激素受体发生变构效应， 进而激活激素效应元件，使报告基因得以表达，其表达量与EDCs的污染程度具有剂量效应关系，可通过检测报告基因的表达量反映EDCs的类激素作用。 重组基因酵母筛选法因其快速、灵敏、简易、廉价、和高通量等优点而成为较为广泛应用的EEDs筛选实验方法之一。 3.报告基因法 报告基因法是一种灵敏、快速、高效的EDCs筛选方法，其原理是利用基因工程技术，通过将已知的顺式调控序列（即反应元件）剪接到报告基因的上游以控制报告基因的表达并构建出基因重组质粒，转染至宿主细胞内。当环境化学物作为细胞外信号与反应元件所对应的特定受体结合后，便可通过信号转导蛋白或转录因子激活反应元件，从而启动宿主细胞中的报告基因的表达。 报告基因的表达产物易被检测，且容易与背景蛋白区别，可以起到细胞信号的放大作用，故通过监测报告蛋白的量便可以反映环境化学物的内分泌干扰效应。 常用的报告基因的类型包括氯霉素乙酰基转移酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白及红色荧光蛋白等。其中荧光素酶因为其敏感性高和线性范围宽，现已成为哺乳动物中最常用到的报告基因类型。 （四）分子筛选法 1.免疫检测法 基本原理是生物分子（受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，然后采用同位素、酶、荧光或化学发光底物等标记技术加以放大和显示，根据生物分子被诱导产生的水平判断化学物质是否具有内分泌干扰特性。免疫检测方法主要包括放射免疫分析法、酶免疫测定法、荧光免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析法和化学发光免疫测定法，其中以EIA和 RIA最为常用。 2. 生物传感器检测法 生物传感器检测法是一种基于免疫技术的仪器测定方法，由一个能与EDCs特异性反应的生物分子（生物识别元件）和一个换能器（传感元件）构成。生物识别产生的物理化 学性质的改变，可以通过换能器转化变为可识别的信号。常用的生物识别元件多为免疫化学的抗体或抗原、酶、非酶受体、完整细胞以及核酸，常用的转换器包括电化学传感器、光学传感器、质量敏传感器和热敏传感器4大类。 生物传感器以其灵敏度高、可大批量检测、价格便宜、可现场检测和自动在线检测等优点，得到广泛应用。 但就目前而言，这一方法仍存在着生物分子的稳定性低、物理化学参数设置和结果中出现干扰数据等问题，亟需后续研究解决。 1、整体动物实验 整体动物实验是最常用的检测甲状腺激素活性的方法，该方法能真实的评价环境内分泌干扰物对动物的干扰效应。 （1）甲状腺激素浓度和组织学检查 血清激素浓度是反映甲状腺功能的最好指标；美国甲状腺协会建议监测血清TSH和FT4作为判断甲状腺功能的指标。但是，由于血清激素浓度容易受到精神因素的影响，有必要同时进行甲状腺的组织病理变化。 五、环境甲状腺干扰物的筛选方法 （2）生长发育的检查方法 甲状腺激素是维持人和哺乳动物正常生长和发育不可缺少的物质，对骨和脑的发育尤为重要。观察生长发育的动物为筛查环境干扰物对甲状腺激素功能的最佳模型，筛查的内容包括： ①神经系统发育检查 ②行为学检查 ③雄性生殖发育系统检查。 整体动物实验灵敏度较高，经济、方便、省时，对某些需要体内代谢活化才有内分泌干扰活性的物质和中间代谢产物可以很好的检出。 但也存在一定的局限性，动物对同一外来的甲状腺激素的反应性个体差异大，受动物年龄、品系、营养状态等的影响。 2、体外实验研究 （1）青蛙变态实验 研究证明，在两栖动物的正常发育过程中，甲状腺激素是导致肢体的生长和分化的必需物质。因此，应用