基因工程相关技术课件.pptxVIP

苏 金 ;疾病相关基因功能研究;基因工程相关技术;;;;;;;;5’---A-G-C-T-A-G-A-A-T-T-C-T-T-A-C-C---3’;;细菌存在限制性核酸内切酶;细菌限制/修饰体系;匹配的粘性末端可直接连接;同尾酶;同裂酶;影响限制性内切酶反应的因素;T4 DNA Ligase;;质粒 DNA;噬菌体DNA;病毒DNA;;强启动子序列;真核表达载体;载体的选择标准;;;人胰岛素;分离;筛选 cDNA 文库;化学合成 DNA; ;引物 dNTP 模板DNA 耐高温 DNA聚合酶;PCR获取目的基因流程;;;PCR---“随心所欲”改造目的基因;引物设计;95℃;琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果;;1. 载体的选择和MCS的分析;;酶切策略;碱性磷酸酶 ;酶切DNA的纯化;互补的粘性末端;如何连接不匹配的粘性末端;修饰末端后连接---;PCR产物的直接连接----T/A克隆;酶切DNA的连接;; 转化 (transformation) 以质粒做载体，将携带外源基因的重组体导入细菌的过程。 转染 (transfection) 指将重组表达载体导入真核细胞的过程。 感染 (infection) 病毒DNA做载体时，若在体外先行包装成有感染力的病毒颗粒，而后感染受体细胞的过程 ;DNA 必须避免被宿主核酸酶降解 ;After growth at 37 ℃ for 10~15 h ;;筛选目的克隆-1;人基因组DNA文库;目的克隆的分析;核苷酸序列测定;筛选和分析目的克隆方法;Blast比对分析;;原核表达产物的应用;;融合蛋白（fusion protein）;His-tag融合蛋白的金属螯合亲合层析 ;包涵体;真核表达产物的应用;真核表达载体;重组DNA转染真核细胞;脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞;HEPES缓冲盐水与含有 CaCl2和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀，粘附于细胞表面，通过内吞作用进入细胞。;电穿孔法;病毒包装;病毒包装;瞬时表达（transient expression）;筛选重组载体稳定转染细胞;;其它实验室赠送;;Thanks for your attention;;5’