应用及实践RealtimeQuantitativePCR.PPT

* * * * * * * * * 实 验 流 程  SYBR Green法实验流程 样本处理 RNA提取 qPCR 数据分析 逆转录 样本处理与RNA提取 外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ RT-PCR一步法还是两步法？ 两步法: 反转录和PCR扩增分两步进行。 步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检测 多个基因。便于反应优化。在工作的初期。 一步法：反转录和PCR扩增在同一管内完成。 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。在工作的成熟阶段。 荧光定量PCR体系 Template Primers DNA聚合酶 Buffer and dNTPs Dye 总原则与普通PCR相同： 避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 - 300bp) 推荐做跨intron设计 引物设计原则 Master