生物制药专业实验ppt课件（吉林大学）实验具体操作四.pptVIP

生活家饮食保健孕期选择食用油的学问邢台市第四病院罕见护理应急预案猪气喘病综合防制技术动物营养系列理想蛋白与氨基酸模式的研究进展皮肤病的诊断包括病史体格检查和必要的实验室检查我国有关食物添加剂营养强化剂食物新资本的治理律例与标准 实验内容 打开分光光度计，预热 上午开水浴55度*2个；100度*2个；35度*4个 下午将2个100度水浴调节为45度 8:00 酶活、蛋白 13:00 正交 13:00凝胶层析（老师完成） 电泳录像是否拷贝？ 今日实验注意事项： 稀释酶液的时候，按照我们的推荐倍数，从高浓度开始，如要稀释5，10，20倍，先稀释成5倍，再将部分稀释成5倍的酶液稀释到10倍。 E1,E2只有2ml，要进行蛋白含量测定+酶活测定+100 μl以后电泳使用；E3虽多，除了以上实验，还有正交试验以及米氏常数的测定。 总之，一次别用完。用来测酶活的稀释后的酶液和原液别急着扔掉，测蛋白含量的时候也许可以在此基础上稀释或使用;另外没有稀释的2个EP管中的E1，E2和离心管内的E3放冰箱里。 稀释合适倍数的标准是最后OD在0.1-0.7以内 测酶活稀释方法举例（稀释5、10、20倍）： E1、E2、E3酶活力及蛋白质浓度的测定 酶活力的测定： 样品前处理：测定E1、E2、E3酶活时，用pH4.6, 0.2mol/L的醋酸缓冲液进行稀释。（E1稀释10倍、20倍,40倍，80倍；E2稀释50倍、100倍，200倍; E3不稀释或5倍，10倍） 空白管中加入E2稀释为最大倍数的酶液2ml，再加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活 其他试管做测定管，分别加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸缓冲液适当稀释过的酶液2ml 所有上述加有酶液的试管（包括空白管）和5%的蔗糖溶液（存放于烧杯中或量筒中）放入35℃水浴中预热恒温（10min）； 分别取2ml 5%的蔗糖加入上述试管中，开始计时，准确反应3分钟，于测定管中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应。 从上述试管中各取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀（注意摇匀方法），于沸水浴中准确反应5min，立即用流水冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测光密度。 酶活力计算：根据葡萄糖标准曲线公式计算出所测定光密度值对应的葡萄糖含量毫克数，按下面公式计算酶活力： 蔗糖酶活力（单位数/1毫升）=葡萄糖毫克数×9×酶的稀释倍数/2/2 蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。 注意： 540nm 蛋白含量的测定： 蛋白含量推荐稀释倍数：E1（大约稀释50、100、200、400倍），E2（稀释5、10或20倍），E3（不稀释或稀释5倍、10倍）。用去离子水稀释即可。 蛋白含量测定：取若干试管各加入1ml已经稀成一定浓度的样品液，其他操作（反应和比色测定）同Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线中第7号试管的操作。空白管加1ml去离子水就可以。 注意：A650 蛋白质浓度的计算：根据Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线公式计算出所测定光密度值对应的蛋白质含量μg数，按下面公式计算蛋白含量： A650值对应的μg数(Pr)×10-3 Pr (mg/ml)= ×稀释倍数 Pr溶液的ml数 （1ml） 实验操作 1、教师汇总收集到E3的峰尖浓缩后进行凝胶层析实验 2、凝胶层析制E4 （1）装柱：将玻璃柱固定垂直，装入脱气的蒸馏水（约为柱体积的 1/3），以避免胶粒直接冲击柱底支持物； （2）固定玻璃柱，调整垂直； （3）装凝胶：边搅拌凝胶，边向柱内缓慢、连续、均匀地装入凝胶(打开柱底端的螺旋夹）不要中断，使胶粒均匀沉降，以免胶面倾斜和发生断层； （4）检查：用眼观察有无凝胶分层、沟流和气泡现象； （5）柱平衡：用脱气水平衡凝胶柱，用出口处的螺旋夹将流速控制在 1ml/min（用量筒和秒表测定）；（提前装好G100） 凝胶层析实验（老师完成） 实验操作 （6）上样：将柱中的5mmol/L pH6.0缓冲液逐渐放出，当液面接近柱床表面时，用长吸管沿柱壁绕环小心加入E3，上样量控制在柱体积的2%-5% （千万不要冲坏柱床表面）；打开凝胶柱出口处的阀门，使样品缓慢、均匀地进入柱床，然后用少量缓冲液清洗柱的内壁，并将清洗液也流入凝胶柱，关闭凝胶柱出口处的阀门。 （7）洗脱：在凝胶上面缓慢加入缓冲液，连接恒压洗脱瓶，开始洗脱 （8）收集：根据记录仪上的蛋白峰手工收集（或者用部分收集器收集）