天然四倍体泥鳅染色体组操作及微卫星研究-chromosome manipulation and microsatellite study of natural tetraploid loach ( misgurnus anguillicaudatus ).docxVIP

摘要鱼类染色体组操作主要包括多倍体的人工诱导、雌核发育和雄核发育等，在鱼类遗传育种中占有重要的地位。本文为探讨鱼类人工诱导四倍体及雄核发育二倍体的新方法，以天然四倍泥鳅、二倍体泥鳅为研究对象，通过冷休克处理抑制第二极体释放，诱导四倍体，对其所产生后代的染色体数目、DNA相对含量、血红细胞核体积及微卫星等进行了较系统的分析；并采用冷休克方法诱导四倍体泥鳅雄核发育二倍体，对其后代的胚胎发育、倍性鉴定及用微卫星标记对雄核发育个体进行分析鉴定。具体结果如下：（1）冷休克诱导泥鳅四倍体的研究：结果表明，血红细胞核体积测定四倍体泥鳅的红细胞核长轴、短轴以及体积都显著大于三倍体（P0.01）。流式细胞仪共检测一龄鱼147尾，其中三倍体泥鳅共31尾，四倍体泥鳅共116尾，占总数的78.9%；对流式细胞仪已确定的三倍体和四倍体泥鳅各3尾的鳍细胞体外培养进行染色体计数。结果显示，三倍体泥鳅染色体数目为3n=75，四倍体泥鳅染色体数目为4n＝100；三种倍性鉴定方法结果一致。本试验采用了15对引物，筛选4对引物（Mac24、Mac37、Mac63、Mac425）用于微卫星标记的分析。结果表明，对照组均遗传父母本的特异性条带，测得四倍体个体的基因型，均为杂合子。本实验通过倍性分析和分子标记的结果分析，证实了2nx4n通过冷休克抑制第二极体释放成功诱导四倍体。（2）冷休克诱导天然四倍体泥鳅雄核发育二倍体：结果表明，实验组中受精率与孵化率均略低于对照，但差异不显著(P0.05)；7天成活率中雄核发育实验组仅有极少数的成活仔鱼（8.30%）与对照组(40.57%)差异极显著(P0.01)。分别实验组和对照组选取20个胚胎，对照组主要分布于71-76之间,其众数在3n=75；而实验组中染色体数量分布于46-80之间,染色体数目为3n=75的有4个,染色体数目为2n=50的有16个为二倍体，诱导率较高。本试验采用了5对微卫星引物中，筛选获得2对引物（Mac45、Mac60）其亲本基因型完全不同，可用于进行雄核发育后代的鉴定。在引物Mac45中可确定母本基因型为106/86,父本的基因为51/53，雄核发育后代中基因型为51/51和51/53，达到26.0%。同样在引物Mac60的微卫星标记中雄核发育后代的遗传父本基因型107/120，而不遗传母本基因，表明雄核发育后代染色体组减半，只遗传物质来自于父本而非母本。研究结果表明，无须卵子失活，仅用冷休克成功诱导了天然四倍体泥鳅雄核发育二倍体及冷休克抑制第二极体释放诱导成功四倍体，该研究结果进一步证实了天然四倍体泥鳅是具有4套染色体组的遗传的四倍体，能产生二倍体（2n）配子，是进行多倍体育种的良好材料，而且为全雄鱼生产及多倍体育种提供了新的途径。关键字：天然四倍体；人工诱导四倍体；冷休克；雄核发育；微卫星Abstractchromosomesoperatingmainlyincludesthepolyploidinduction,gynogenesisandandrogenesis,andisimportantforfishgeneticbreeding.Toexplorethenewmethodsfortetraploidyandandrogeneticdiploidforfish,theresearchselectedthenaturaltetraploidandthediploidloachasexperimentalobjects,utilizedthecoldshocktreatmenttosuppressthesecondpolarbodyreleaseandinducethetetraploid,andthensystematicallyanalyzedthechromosomenumber,relativecontent,thevolumeofredbloodcellnucleiandmicrosatelliteDNAoftheproducedoffspring.Atthesametime,theresearchalsousedthecoldshocktreatmenttoletthetetraploidloachgenerateandrogenesisdiploid.Nextweanalyzedtheoffspringwithembryonicdevelopment,ploidyidentificationandmicrosatellitemarkers,theresultsareasfollows:Coldshockinducedtetraploidloach:Inthisexperiment,Identificationresultsshowthenaturaltetraploidloachma