核酸的杂交(分子生物学)朱.096学时.ppt

核酸的杂交 核酸杂交基本类型 主要内容 一、核酸杂交的基本原理（掌握） 二、核酸探针（熟悉掌握） 三、杂交技术（了解） 第一节 核酸杂交的基本原理 一、核酸的变性 2 变性方式 （1）DNA热变性：是最常用的方法，一般加热 80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。 （2）热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。 影响Tm值的因素 2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑ 3 变性过程 DNA变性过程是一个逐渐的过程：AT区先解链，GC区后解链。 二、核酸的复性 1．概念：变性DNA两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程。 2．特点 1）理化性质 恢复。 2）生物活性 部分恢复 3 核酸复性的阶段 （1）成核阶段：两条单链局部碰撞，形成双链； (2) 拉练式阶段：在成核基础上，其余部分碱基互补 4．影响复性过程的因素 单链核酸的起始浓度：反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率，浓度越高，复性越快。 核酸链长度（分子量）：分子越长，扩散越慢，形成配对的难度也大，复性也慢。 核酸分子的复杂性：复杂性即核酸分子中不同序列的总长度，复杂性越高，形成正确配对的难度也越大，复性越慢。 温度：温度过高有利于变性；过低则分子运动减慢，少数碱基形成的局部双链也不易解离。适宜的复性温度是比Tm低25℃。 离子强度（盐浓度）：适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电，减少双链间的静电斥力，有利于复性。离子强度过高则不利于复性。 三。核酸杂交概念： 利用变性作用将DNA双链分开，加入不同来源的DNA单链或RNA链，经过退火处理，不同来源的两条多核苷酸链依靠碱基互补关系形成杂种双螺旋的过程。 影响核酸杂交的因素 第二节 核酸探针 一、探针的概念 核酸探针的概念 二、探针种类和选择 基因组DNA探针 制备：一般从基因文库中选取某一基因片段与载体连接，克隆后酶切得到 1. 基因组DNA探针 从基因组DNA文库中选取某一基因片段 重组 DNA 导入受体菌 2. cDNA探针（complementary DNA） 3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 2. cDNA探针（complementary DNA） 3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少,未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 三、探针设计原则： ①长度：10~50bp 四、探针标记物的选择 理想的标记物： 寡核苷酸探针 制备：先设计一个20～50个碱基的核苷酸顺序，在DNA合成仪上合成 设计探针的原则 （1）探针长度10~50bp （2）G-C为40~60% （3）避免同一碱基的连续出现?4个 （4）避免碱基反向互补碱基对应4 bp (5)与非靶基因序列有70%以上的同源性，应重新设计 三、探针标记原理 理想探针标记物的特征： 探针标记物：1）同位素标记； 2）非同位素标记 （一）放射性同位素标记物 （二）非放射性标记物 １。半抗原 如生物素等； ２。配体 如抗生物素蛋白卵白素； ３。莹光素 如罗丹明； ４。化学发光。 荧光标记物 四、探针放射性同位素标记法 2）基本原理 3）方法 2。随机引物法 3）基本原理 4）随机引物法的方法 五、非放射性探针标记 1。光敏生物素标记核酸 2。酶促生物素标记核酸 3。酶标 六、核酸探针检测 2、非放射性探针检测方法 3.非放射性探针检测显色体系 2）HRP显色体系： 第三节 核酸分子杂交技术 分类：一、液相分子杂交， 二、固相分子杂交 一、液相分子杂交 两条杂交的核酸链游离在溶液中，在一定条件下（温度、时间等）进行杂交，然后除去没有杂交的探针，得到杂交核酸分子。 二、固相分子杂交 待测靶核苷酸预先固定在固体支持物上，标记的探针则游离在溶液中进行杂交，最后使杂交分子留在支持物上 固相分子杂交分类 １。膜上印迹杂交（最常用） ２。细