ELISA检测原理及手足口疾病诊断中作用.ppt

ELISA基本原理及在手足口病实验室检测中的应用 内 容 ELISA的基本原理 ELISA的种类 ELISA的组成 ELISA结果判定 ELISA中的几个重要影响因素 ELISA的质量控制 ELISA在手足口病致病病毒检测中的应用。 1. ELISA的基本原理 ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay ——酶联免疫吸附实验）是20世纪60年代发展起来的免疫学检测技术，也是目前应用最广泛的传染病检测方法。 ELISA的特点： 敏感度和特异度较高，重复性好。 试剂比较稳定，易于保存。 操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。 易于标准化和对检测对象进行定量。 可以自动化。 抗原抗体反应 抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。 IgG和IgM抗体的三维结构 将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。 抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。  2.ELISA的种类-检测抗原 竞争法 ELISA——将特异性抗体包被于固相载体表面，洗涤后分为两组，一组加入酶标抗原和被测抗原的混合液，另一组只加入酶标抗原，经孵育洗涤后加底物显色，两组吸光度之差就是所测定未知抗原的量。 包被特异性抗体 酶标抗原 检测抗原 孵育 洗涤后显色 加样 A B 3.显色 3.孵育 1.加样 检测抗原 双抗体夹心法ELISA ——将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。 检测抗原 1.加样 2.孵育 3.洗涤 4.加入二抗 5.孵育 6.显色 酶标特异性抗体 包被特异性抗体 检测抗体 间接法ELISA（Indirect ELISA）——将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。 1.加样 2.孵育 3.洗涤 4.加入二抗 5.孵育 6.显色 检测抗体 捕获法ELISA（Capture ELISA）——专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。 1.加样 2.孵育 3.洗涤 4.加入抗原 孵育 5.加入二抗 孵育 6.显色 检测抗体 双抗原夹心法ELISA——检测标本中的总抗体（包括IgM和IgG型抗体） 。将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色。 3.洗涤 1.加样 2.孵育 6.显色 5.孵育 4.加入酶标 抗原 3.ELISA试剂的组成 固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是聚苯乙烯材质的微孔板，多为8× 12道96孔板条。 酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反应。 辣根过氧化物酶（HorseRadish Peroxidase，简称HRP）是目前应用最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase ，简称AP）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。 底物：不同种类的酶要求使用不同的底物。 HRP—邻苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD） 、四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS 『2,2‘-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)』，OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性差。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。 AP—对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。 洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是吐温20（聚山梨酯 ）。 标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。