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HBV cccDNA检测方法及应用价值研究进展 　　【文章编号】1004-7484（2014）05-2942-02 　　我国是肝炎大国，约有一亿三千万慢性乙肝携带者，由于慢性乙型肝炎是肝硬化和肝细胞癌的高危因素[1]，并且在我国每年约有30万人死于肝硬化和原发性肝癌[2]。因此对于乙型肝炎的诊断、治疗显得尤为重要，但是在治疗过程中存在着用药疗程、耐药、停药后复发等一系列问题导致肝炎久治不愈，主要原因之一是由于HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）的存在及消除困难。本文主要对HBV cccDNA检测方法及其在临床上应用价值进行阐述。 　　1 cccDNA的分子结构 　　HBV是嗜肝细胞病毒，当其感染进入肝细胞后，在细胞质脱衣壳并释放松弛环状DNA（rcDNA）， rcDNA是两条链均不闭合，负链较长的DNA分子，随病毒复制进行，rcDNA进入细胞核，利用宿主细胞胞核中DNA聚合酶、拓扑异构酶等形成HBV共价闭合环状脱氧核糖核酸（covalently closed circular DNA， cccDNA），再以cccDNA为模板，在RNA聚合酶及逆转录酶的作用下合成前基因组RNA和mRNA，进一步合成负链DNA分子及核心蛋白、脂蛋白等蛋白质，最后，以负链DNA为模板，合成正链DNA，正负链组成新的rcDNA，一部分由脂蛋白包绕形成HBV病毒颗粒释放，另一部分变成cccDNA来维持胞核内cccDNA的水平。HBV感染过程如图一所示[3]： 　　新合成的HBV会感染新的肝细胞重复上述过程，当胞核中cccDNA的含量过高时，直接以cccDNA为模板合成HBV，使cccDNA动态维持在某一水平，在肝内形成了“cccDNA池”。可以看出cccDNA是HBV复制的重要中间体，且cccDNA对常规的抗病毒药具有抵抗作用[4]，当抗病毒药物使血清中HBV DNA水平下降后，肝细胞中的cccDNA又会“生产”新的病毒并释放，HBV又会继续感染肝细胞，重复感染过程，又使肝内cccDNA也得到补充。 　　由于cccDNA的存在且难以清除是导致肝炎久治不愈的原因之一，所以对于cccDNA的检测有其必要性，下面对其检测方法进行阐述： 　　2检测方法 　　2.1 Southern Blot方法 　　最经典的基因分析方法，基本过程包括：将电泳分离后的DNA片段转移到硝酸纤维膜等固相支持物上，用已标记的探针与之进行杂交，然后分析杂交信号。以往多用此方法进行检测，是一种定性的方法，但是对操作者的要求较高、标本需求量较大、操作步骤较繁琐、敏感性较低等缺点[5]，临床上应用较少。 　　2.2 PCR检测法 　　PCR技术是DNA体外扩增技术，上个世纪80年代新兴的分子生物学技术，近些年发展迅速，技术逐渐成熟，应用其基本原理发展出很多衍生技术，并已在临床广泛使用。 　　2.1 普通PCR 　　基于rcDNA的正负链都存在缺口，设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不被扩增，具有完整双链的cccDNA可被选择性扩增[6]。 　　2.2 实时荧光定量PCR 　　He等建立了实时荧光定量PCR技术检测cccDNA[7]。他们设计位于负链缺口下游与负链互补且具有发光和淬灭集团的TaqMan探针，在上游引物的指导下进行扩增，若负链是完整的，Taq酶到达探针结合位点， 探针被切断，淬灭集团失去对发光集团的抑制，产生荧光；反之，若负链不完整则不产生荧光。应用该技术可使结构不同的rcDNA与cccDNA区分开。并对反应进行实时动态监测，减少产物污染。 　　2.3 套式PCR检测法 　　套式PCR是用两对引物先后扩增同一样品，一般情况下第一对引物先扩增一段较长靶基因，加入第二对引物，以扩增产物为第二次扩增的模板，扩增部分片段。由于存在二次扩增，该方法与传统PCR相比，灵敏度和特异性均有提高。郑守虎等应用套式PCR技术检测200例慢性乙肝患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA，阳性率为60%，该法简便、灵敏，可用于测定外周血单个核细胞中HBV cccDNA[8]。 　　2.4 竞争性PCR检测法 　　在靶基因DNA序列中插入或缺失一段核苷酸序列，将此变异体作为参考模板，将靶基因与参考模板在同一反应管中共同扩增，参考引物与靶基因竞争聚合酶、核苷酸及引物分子等合成所需原料。在恒量的待测靶基因中加入系列稀释后的参考模板进行扩增，电泳分离PCR产物，根据已知量的参考模板，可推算出待测样本的初始浓度，达到定量的目的。该方法除了应用PCR技术，还需进行凝胶电泳、Southern Blot及同位素探针等来完成，不易于标准化[9]。 　　2.5 入侵检测 　　入侵检测是近些年的新兴技术。原理是根据目的基因设计一对探针，一个是初始探针，一个是入侵探针，初始探