猪心去蛋白提取物原液主要组成成分研究课件.pptVIP

猪心去蛋白提取物原液结构 主要组成成分研究 摘 要 本实验所用样品为猪心去蛋白质提取物原液，其成品应用于医疗领域。实验主要是对此原液进行结构确证，即主要组成成分研究。初步分析本品中可能含有的三类生化物质是蛋白质，核酸，糖类。表明本品主要成分为蛋白质类。因此，本实验采用以下几种颜色反应，即茚三酮反应，双缩尿反应，二苯胺反应，地衣酚反应和蒽酮反应分别对蛋白质类物质，肽类物质，DNA结构物质，RNA结构物质以及糖类物质等进行鉴定，以便确定此样品中是否含有这些成分。 关键词 颜色反应；紫外扫描光谱分析；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；排阻高效液相色谱分析； 序 言 注射用猪心去蛋白提取物为以健康猪心脏为原料，通过现代生物技术手段制备的小分子多肽类物质。具有改善心肌供血状况及心脏功能，增加心肌利用氧，促进机体代谢，保护细胞，修复受损的内皮细胞，恢复心肌细胞功能，改善心血管再灌注损伤及血液循环障碍等作用。 本试验的目的是对制成此药品的猪心细胞原液进行结构确证。通过颜色反应分析、紫外扫描分析、SDS分析、排阻高效液相色谱分析及组分含量分析等方法对本品原液的化学结构或组分进行了研究，确证了本品原液的主要组成成分为蛋白质类，即多肽和氨基酸。 实验步骤 一、提取过程 二、颜色反应分析 三、紫外吸收分析 四、样品多肽含量分析 五、 SDS-聚丙烯酰胺电泳分析 六、排阻高效液相色谱分析 一、提取过程 ⑴ 材料处理: 取新鲜或冰冻猪心，除去脂肪和韧带，用水洗去积血，将猪心切成小块，放入绞肉机绞碎。 ⑵ 提取: 称取绞碎猪心肌肉500克，放人2000m1烧杯中，加蒸馏水1000ml，在电动搅拌器搅拌下以2M H2S04调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2小时，在提取过程，使抽提液的pH值保持在4.0左右。在即将提取完毕，停止搅拌之前，以1M NH40H调pH至6.0，停止搅拌。用八层普通纱布压挤过滤，收集滤液。滤渣加入750m1蒸馏水，再按上述条件提取1小时，两次提取液合并。 ⑶ 中和: 用1M NH40H调上述提取液至pH 7.2(此时，等电点接近7.2的一些杂蛋白溶解度小，从溶液中沉淀下来)，静置30～40分钟中后过滤，所得滤液 实验过程 （1）茚三酮反应 二、紫外吸收分析 本实验是通过对样品溶液在200-400nm范围内进行扫描，看此样品的最大吸收是否在蛋白质类物质的吸收范围内的定性分析，来鉴定本样品中是否含有蛋白质类物质。将本品原液用纯化水适当稀释后，分别加入纯化水、乙醇、0.1mol/L氢氧化钠等作为样品原液的溶剂，放入分析仪，在200-400nm范围内扫描。 仪器显示屏上的最终结果是：样品的最大吸收波长在250nm附近，这在蛋白质类物质的吸收范围之内； 酸性溶液中的紫外吸收光谱无太大变化； 碱性溶液中发生偏移，此为蛋白质类物质的特性。以上结果进一步证明样品中的主要成分为蛋白质类物质。 三、样品多肽含量分析 双缩尿法测蛋白含量的原理是蛋白质有两个以上的肽键（-CO-NH-），因此有双缩尿反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围1-10mg蛋白。 双缩脲标准曲线比色液用量表 最终的坐标曲线如图 四、SDS-聚丙烯酰胺电泳分析 聚丙烯酰胺凝胶电泳是由一定量的单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在加速剂和催化剂共同作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶，以这种凝胶为支持物进行的电泳就称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂盛大，SDS与蛋白质结合后，引起蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，他们在水溶液中的形状，近似于长椭圆棒。不同的蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。 SDS-不连续系统不同浓度凝胶配置用量表 标准品分子量对数对电泳迁移率图 五、排阻高效液相色谱分析 排阻高效液相色谱分析是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 六、结论与讨论 1．实验结论 本实验的结论为：本品经颜色反应，确定了样品中含有蛋白质类物质，肽类结构物质，无DNA结构的物质，不含有RNA结构的物质，含有极微量的糖类物质。后用紫外吸收分析进一步证实了样品溶液中的主要成分为蛋白