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一种快速提取微藻完整叶绿体及其DNA的方法 　　摘要：利用高盐结合SDS裂解法，对杜氏盐藻、湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻叶绿体及其DNA进行分离和提取。经超声波匀浆后差速离心，可获得比较完整的叶绿体，再经有机试剂萃取，可得到产率较高、纯度较好的叶绿体DNA，经PCR扩增得到清晰的条带。本试验方法快速简便，DNA质量可以满足后续分子生物学操作需要。 　　关键词：微藻；叶绿体；叶绿体DNA；提取方法 　　中图分类号： Q244；S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0066-03 　　收稿日期：2015-01-15 　　基金项目：广东省深圳市科技项目（编号：JC201005280534A、JCY20130331151022276）；广东省自然科学基金（编号：10151805501000007）。 　　作者简介：潘远健 （1987―），男，广西梧州人，硕士研究生，从事基因调控研究。E-mail：wenrenzhiying@163.com。 　　通信作者：金刚，博士，教授，主要从事水生生物学研究。E-mail：jingang@。叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器。20世纪初，学者根据植物叶片的花斑现象具有母性遗传的特性，推断在叶绿体上或许存在核外的遗传因子。20世纪60 年代初，随着电镜技术与分子生物学技术的发展，叶绿体基因组的存在由Gupta等证实[1]。目前，叶绿体DNA（cpDNA）被广泛应用于细胞质遗传、植物系统发育、植物雄性不育、亲缘关系、叶绿体转基因等研究中。微藻作为水体生态系统重要的初级生产者及潜在的外源基因表达载体，研究其叶绿体和cpDNA功能、结构特征，对于叶绿体表达体系构建具有重要作用。因此，快速、简便地获得质纯、量大cpDNA是许多工作的前提。目前，获得微藻完整叶绿体和纯度高、浓度大的微藻cpDNA存在一定困难，主要原因是微藻种类繁多，每种微藻有其生物学特点，缺乏通用方法；叶绿体DNA含量较少，在提取过程中存在诸多干扰因素 （核DNA、RNA、蛋白质等）。 　　提取植物cpDNA的传统方法有CsCl2梯度离心及DNaseⅠ结合蔗糖梯度离心等，这些方法操作较繁琐，不易同时获得理想的产率、纯度。20世纪80年代至今，在非藻类植物叶绿体提取、微藻叶绿体分离技术等方面研究成果较多[2-9]。本研究在前人研究的基础上作了一些改进（如离心时间和速度、藻体破碎方法、叶绿体破碎时间、DNA分离时的离心速度和时间等），提取杜氏盐藻（Dunaliella salina）、湛江叉鞭金藻（Dicrateria Zhanjiangensis）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）的完整叶绿体，结果较为满意。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　杜氏盐藻、湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻由笔者所在实验室培养。 　　1.2试剂配制[7] 　　缓冲液A：400 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0）、20 mmol/L EDTA-Na2、0.2% BSA、0.2%巯基乙醇（现用现加）；缓冲液B：400 mmol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl （pH值 8.0）、0.1% BSA；缓冲液C：1.25 mol/L NaCl、50 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl（pH值 8.0）；缓冲液D：100 mmol/L Tris-HCl（pH值 7.8）、50 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl、0.2%巯基乙醇（现用现加）。试验所用试剂蛋白酶K、DNase Ⅰ、DNA Maker等购于宝生物工程（大连）有限公司。 　　1.3分离叶绿体和提取cpDNA[9] 　　把生长到对数期的微藻置于0～4 ℃暗处理24 h。将暗处理后的500 mL藻液分装到50 mL离心管中，4 ℃下 5 500 r/min 离心2 min收集藻细胞（沉淀），弃上清。往以上所得沉淀加入30 mL缓冲液A，冰上破碎1.5 min得藻体破碎液。将藻体破碎液用6层滤网（300目）过滤，滤液倒入离心管中，4 ℃ 1 000 r/min离心20 min，收集上清。将上清液在4 ℃ 4 000 r/min离心20 min，弃上清，将沉淀保存于4 ℃冰箱备用。DNA酶去核处理：往上一步所得沉淀中加入200 μL 缓冲液B、2.5 μL DNase-Ⅰ、40 μL 0.2 mol/L MgCl2，37 ℃静置15 min。加入200 μL 0.4 mol/L EDTA-Na2，再加入缓冲液C，4 ℃ 4 000 r/min离心20 min，弃上清。在上一步所得沉淀中加入600 μL 预冷的缓冲液D，30 μL 20% SDS（终浓度1