上调Sema3A表达水平对结肠癌细胞侵袭增殖能力影响.docVIP

上调Sema3A表达水平对结肠癌细胞侵袭、增殖能力的影响 　　[摘要] 目的 探索上调Sema3A表达水平对结肠癌细胞侵袭、增殖水平的影响。 方法 构建Sema3A正义表达载体，慢病毒包装后感染人结肠癌SW620细胞，获取稳定过表达的Sema3A结肠癌细胞株。实验同时设置空白对照组、阴性对照组。行Transwell、MTT、克隆形成实验探索过表达Sema3A对SW620生物学行为的影响。 结果 成功构建过表达Sema3A的人结肠癌SW620细胞株。与阴性对照组比较，Sema3A过表达细胞株的增殖速度减慢，克隆形成率下降，侵袭能力降低，差异均有高度统计学意义（P 0.01）。 结论 外源性上调Sema3A表达水平可降低SW620体外增殖、侵袭转移能力，提示Sema3A对结肠癌生长、侵袭存在抑制作用。 　　[关键词] Sema3A；结肠癌；增殖；侵袭 　　[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（c）-0013-04 　　结肠癌（Colorectal cancer，CRC）为最常见的消化道癌症之一，发病率高居恶性肿瘤的第三位。西方国家结肠癌死亡率高居癌症类疾病前三位[1]。随着饮食结构变化，近年我国CRC发病和死亡人数逐年递增[2]。从良性腺瘤或囊肿发展到晚期结肠癌、转移瘤，包含了基因、蛋白质水平的多重改变[3]。臂板蛋白3A抗体（Semaphorin3A，Sema3A）是导向蛋白Semaphorin家族中的重要分子之一[4]，其有拆解细胞骨架、纤丝状肌动蛋白等功能[5-6]。随着研究的深入，发现Sema3A除了可以促进神经元生长、再生，还能调节肿瘤细胞的生长、增殖水平[7]。在多种癌症组织或细胞中，Sema3A均有不同程度的表达下调或缺失，从而抑制癌细胞的增殖、侵袭、转移[8]。本研究旨在观察Sema3A在结肠癌细胞侵袭、增殖中的作用，探索过表达Sema3A对结肠癌细胞的生物学行为的影响，揭示其抑制结肠癌增殖、侵袭的作用机制，为临床研究提供相应试验依据。 　　1 对象与方法 　　1.1 仪器与试剂 　　人结肠癌细胞株SW620引自中科院上海细胞库。慢病毒病毒载体（Lentivirus-Sema3A）、阴性对照载体（CON145）以及慢病毒包装试剂盒（上海吉凯基因化学技术有限公司）。四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），胰酶（上海化学试剂有限公司试剂一厂），荧光显微镜（日本Olympus），CO2孵箱（日本Sanyo），生物安全柜（上海振梓创空气净化设备有限公司），RPMI 1640培养液（美国Gibco），Trizol（美国Invitrogen），PCR引物、反转录试剂盒以及SYBR Green Real-time PCR Masker Mix试剂盒（日本TaKaRa），MTT（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），Elx800酶标仪（美国BioTek），Giemsa染液ECM550（美国Chemicon），多聚甲醛[生工生物工程（上海）股份有限公司]，RnaseA ENO531（加拿大Fermentas），Transwell小室（美国Corning），酶标仪（美国Thermo）。其余试剂为本实验保存。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 于37℃、5%CO2、饱和湿度条件，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养SW620，实验细胞取对数生长周期细胞。 　　1.2.2 慢病毒载体构建 上海吉凯基因化学技术有限公司构建过表达Sema3A慢病毒载体（Lentivirus-Sema3A），其表达绿色荧光蛋白（GFP）。胰酶消化SW620细胞后配制成细胞悬液，以数量约为5×105的细胞悬液接种于6孔细胞培养板中，放置孵箱中待细胞融合度达30%，以细胞感染复数（MOI）值（MOI为20）加入相应量慢病毒。设置空白对照组（CON组）、阴性对照组（N1组，仅有GFP）、过表达Sema3A慢病毒细胞组（SE，携带Sema3A+GFP）。转染16 h后换液。转染72 h荧光拍照，以GFP观察感染率，若荧光率80%收集细胞，提取RNA以进行Real-time PCR试验。 　　1.2.3 Real-time PCR试验 用Trizol等有机溶剂提取总RNA，进行RNA含量和质量检验后，选择纯度较高的RNA用于后续实验。首先将总RNA反转录为cDNA：37℃，15 min，反转录反应；85℃，5 s，反转录酶的失活反应。之后进行Real-time PCR试验：95℃，5 s变性60℃，30 s退火延伸；共30个循环。以β-actin作为内参基因，Sema3A和β-actin引物序列由Takara公司设计合成。 　　1.2.4 SW620细胞