第八章放射免疫分析和其它标记免疫分析.ppt

第八章 放射免疫分析和其它标记免疫分析 第一节 放射免疫分析技术（RIA） 利用特异抗体与标记抗原和非标记抗原的竞争结合反应，通过测定放射性复合物来计算出非标记抗原量的一种超微量分析技术。 一、基本原理 一定量的抗体(Ab)与一定量的特异性标记抗原(*Ag)及非标记抗原(Ag，包括待测抗原与标准品)在一定条件下发生可逆性竞争结合反应，形成一定量的抗原-抗体复合物(*Ag-Ab、Ag-Ab)，反应达到平衡后，分离抗原-抗体复合物与游离抗原，通过非标记抗原的量与复合物的放射性强度成反比关系，求出待测抗原的含量。 Ag + *Ag + Ab ? *Ag-Ab + Ag-Ab + *Ag Ag *Ag Ab Bound Free B F B/F 0.67 0.33 2 0.5 0.5 1 0.33 0.67 0.5 0.17 0.82 0.2 二、放射免疫分析的基本方法 1.基本试剂──抗体、标记抗原、非标记抗原 ①抗体（Ab） 高亲和力 →斜率高的曲线→高灵敏度、高精密度 高特异性 →减少干扰物的影响 高滴度 →减少成本、减少干扰 ②标记抗原（*Ag) 比活度和放化纯度足够高 →灵敏度 半衰期足够长 →完成分析过程 不改变抗原原有特性(特异性、亲和力、免疫活性) 标记原子数量、标记方法、保存 2.复合物与游离抗原的分离 ①液相反应体系 双抗体沉淀法 聚乙二醇沉淀法 葡萄球菌A蛋白沉淀法 活性炭吸附法 微孔滤膜过滤法 其它：盐析法、层析法、电泳法等 ②液-固反应体系 抗体吸附在固相支持物上，抗原抗体反应复合物就结合在固相上，反应结束后除去固相周围的液相，测定固相的放射性。 固相材料： 塑料（聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙）、纤维素、凝胶颗粒（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺）、多孔玻璃微球等。 要求： 吸附牢固，吸附的抗体量足够多； 吸附后不影响抗体免疫活性； 非特异结合低； 吸附材料理化性质稳定； 吸附材料廉价易得。 ③分离效果不良表现 非特异结合偏高，特异结合变化不明显－游离抗原 特异结合偏低－分离剂 特异结合在分离过程中逐渐降低－复合物解离 3.基本步骤 ①加样：标准品、样品、标记抗原、抗体 ②孵育：温度、时间 ③分离：根据反应系统类型 ④测量：固闪、液闪 ⑤数据处理：专门软件、手工计算 一般RIA基本操作程序(μl) NSB管 B0管 标准管 样品管 缓冲液 200 100 － － 各级标准 － － 100 － 样品 － － － 100 标记抗原 100 100 100 100 抗体 － 100 100 100 充分混匀，4℃过夜或37℃ 1～n小时 分离剂 500 500 500 500 混匀，放置一定时间，分离，测量 三、数据处理 1.手工计算 已知数据： 标准品的剂量Cs及相对应的结合测量值Bs 非特异结合测量值BN 最大结合测量值B0 各样品测量值Bx 计算：LogCs、(Bs-BN)/(B0-BN)、 (Bx-BN)/(B0-BN) 标准曲线绘制：以LogCs为横坐标，以(Bs-BN)/(B0-BN)为纵坐标，做一直线回归。 样品剂量计算：通过(Bx-BN)/(B0-BN)在直线上的对应值计算出各样品的浓度。 2.计