FISH技术及其临床应用3.ppt

荧光原位杂交技术及其在医学中的应用FISH methods and its medical application 刘 京 昇 一、荧光原位杂交 （fluorescence in situ hybridization,FISH) 60年代 Pardue Gall 建立 （一）方法与原理： 制备DNA探针（用生物素或荧光素标记）（下图）→变性﹢制备CS或间期细胞标本→变性处理→探针与待测DNA杂交→洗脱→用荧光素标记的生物素亲和蛋白使杂交区发荧光（信号放大）(下图） → 荧光显微镜检测 （二）探针制备方法 1.缺口平移法(Nick translatrion) 用生物素（biotin)标记dUTP DNA酶Ⅰ切口 DNApolymerase Ⅰ 5`→3`外切酶活性 DNApolymerase Ⅰ 5`→3`聚合酶活性 分子杂交与信号放大 FISH Procedure Denature the chromosomes Denature the probe Hybridization Fluorescence staining Examine slides or store in the dark （三）探针种类 1）探针池探针（cs涂抹探针）：可结合在整条CS上每一部位。 24色（常CS22条＋XY） 2）着丝粒探针：结合于着丝粒处，检测间期核内DNA数（CS数） 3）端粒探针：结合于端粒处 5）染色体臂涂抹探针：结合于cs的q或p上。 （四）探针标记方法 间接标记（前述） 时间长 信号明显 直接标记 时间短 信号弱 二、FISH种类： 以FISH过程中探针结合部位或探针颜色的不同，将FISH分为多种。 三、 FISH优点（ Advantage）: less labor-intensive method for confirming the presence of a DNA segment within an entire genome than other conventional methods FISH - a process which vividly paints chromosomes or portions of chromosomes with fluorescent molecules identify the presence and location of a region of DNA within morphologically preserved chromosome preparations, then can identifies chromosomal abnormalities often used during M phase but is now used on interphase as well 四、FISH在医学中的应用举例 1、用已知探针检测未知CS畸变 2、用显微切割方法检测未知CS畸变 显微切割→PCR →CS特异探针 池(黄色荧光) →与正常人CS杂交 (例:2号染色体某段发黄色荧光) 结果？ 3、产前诊断 例:检测间期细胞 内DNA分子数 例：21三体 例：18三体 4、植入前诊断 5、肿瘤诊断 肿瘤诊断探针 检测间期细胞内DNA分子数 肿瘤细胞内有癌基因扩增 7.遗传病诊断 （图） 例1： 家系1 FISH结果 用Xcs着丝粒探针 （绿色）和DMD exon46探针(红色） 杂交。 图示DMD男患者FISH 结果：只有Xcs着丝 粒绿色信号，无DMD exon46红色信号， 说明？ 7.遗传病诊断 （图） 7.遗传病诊断 （图） 7.遗传病诊断 （图） 7.遗传病诊断 （图） 7.遗传病诊断 （图） 8、基因定位(略)（参下页图) 附:FISH试剂盒例子（参资料） Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) 图示1例13/14罗式易位携带者的胚胎植入前FISH诊断 资料：一对6年不育，女，32岁，cs正常，男34岁，核型：45，XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。 采用单精子卵泡浆（intracytoplasmicsperm injection,ICSI)辅助授精，胚胎发育到3天6-8细胞期取出一个细胞进行双色FISH检测。 参图：用13q和14q探针，见核中2个13号（绿色）和2个14号（红色）信号细胞，表明？ 移植后18周做羊水细胞CS检查 PGD 肿瘤诊断 慢性粒细胞白血病 慢性粒细胞白血病 慢性粒细胞白血病 6.微小染色体畸变检测 Microdele