组织化学技术管理5-免疫组化.pptVIP

从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。1～5均因对照组的结果已否定Ab的特异性or因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验or换用Ab。 ★ 除上述对照结果分析之外，还必须从以下几 个方面综合评价： 1．阳性染色特点 ① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构 性。（非特异性～细胞与组织无区别） ② 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染 色 弥散性均匀） 2．组织切片制作过程的影响 ① 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体 时勿干片。 3．人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。 第三章 免疫组织化学 前言 免疫组织化学（Immunohistochemistry） 又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支， 它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织 内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原 位检测技术。 2．免疫组织化学的技术分类 （1）根据染色方式分成：① 贴片染色 ② 漂浮染色 （2）根据Ag—Ab结合方式分成： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法 （3）按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法） 3．标记物 （1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一 般是不可见的，若在镜下检测，则必须 具有可视性标记物。 （2）常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光 素（Fluorescein isothiocyanate ， FITC） —— 荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明（rho—damine RB200） ——荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③ 生物素：（Biotin） ④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护 难一般不用） 4．应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。 一、免疫组织化学技术 （一）染色方法 1．直接法 荧光素直接标记特异性抗体（—抗） 上，标记抗体与抗原结合（在切片上） 荧光显微镜下观察→检测抗原。 △ 酶标抗体要显示后镜检。 直接法优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。应用：基本不用了！！ 2．间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动 物的 IgG抗体）。※显色后镜检 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。 3．非标记Ab桥法： “桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体， 其二抗为未标记桥抗体。 （1）单桥法 (2)双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 ★ 特别提示：注意动物种属关系 4．PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法） ~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗 原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。 该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。 5．ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复 合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex method，ABC法） Avidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有4个 与生物素相结合的位点。 Biotin ： 生物素—维生素H，两者亲和力巨 大，牢不可破。 （1）ABC复合