年产16Kg胸腺素发酵工厂初步设计.doc

李文涛：年产16kg胸腺素发酵工厂设计 安徽工程大学毕业设计（论文） - PAGE 60 - - PAGE 59 - 引言 随着生物技术的发展，通过基因工程手段，构建工程菌，表达外源基因，产生大量的生物蛋白，并且分离纯化技术也不断提高，基因药物蛋白已经进入工业化生产阶段。目前常用的的表达系统为大肠杆菌表达系统和酵母菌表达系统。大肠杆菌遗传背景清楚，繁殖快，培养简单，成为现代基因工程药物生产中最常用的表达系统。毕赤酵母表达系统是在酿酒酵母的基础上构建的工程菌，其碳源为甲醇，也应经成为常用的表达系统之一。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。PAOX1是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAOX1可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。分离纯化技术也不断的完善，针对不同蛋白，不同的的表达系统制定不同的表达方案【1】。 本课题以设计以模拟的形式对年产16kg大肠杆菌表达系统生产胸腺素的工厂进行初步设计。发酵工艺采用深层发酵，通气式培养，发酵罐采用搅拌式 本发酵工厂初步设计主要完成工艺流程选择与论证、工艺计算、车间布局及辅助工程等方面的初步设计和设计说明书一份，并采用CAD完成“生产工艺流程图”、“车间布置图”、“全厂总平面布置图”等相关图纸。 液体菌种采用深层发酵工业化生产，周期短，产量大，目前国内工程菌深层发酵技术的使用非常普遍。从生产规模、生产周期、经济效果等方面看，深层发酵均占有优势。 绪论 1.1 基因工程药物发酵工厂概述 70年代重组DNA技术问世以来，基因工程得到迅速的发展。利用基因工程技术生产药物成为继抗菌素之后的另一代新药。1988年，上海医药院首次承担长春生物制品研究所干扰素车间工程设计，年产干扰素40克。从日本引进30升、100升发酵罐，美国引进400升发酵罐，均带罐温、罐压、空气流量、pH、溶解氧尾气分析的自控装置。根据生产特性，将生产区划分为100万级、10万级、1万级及100级4个洁净区，种子为10万级，发酵、离心及洁净走廊为100万级，层析室为1万级，超滤除菌工序设于100级装配式洁净室内。投产后填补了中国干扰素生产的空白。1995年，上海医药院为上海华新生物高技术有限公司设计白介素-2和干扰素22b工程，采用建设单位提供的科研工艺，以机械方法破碎细胞，可免除化学裂解法后处理操作的困难，关键设备在线控制发酵罐、高速低温离心机和层析仪等均为引进，保证产品质量。此外，根据基因工程生产中系统多和负荷分散的特点，冷冻机采用多机头制冷机，可按不同负荷随时停开，达到快速制冷和节能目的 随着技术的引进，各大院校的人才培养和科研单位的大力投入，培养出多种工程菌，满足并经过一定的途径进入到实际的发酵工厂中，形成了一条高技术院校和科研单位发展上游技术，构建工程菌，发酵工厂引进并发展下游技术，进行中试扩大并最终投产盈利的模式。 1.2 大肠杆菌表达系统深层培养概述 深层发酵是指微生物在液态的培养基中的发酵过程，它是将菌种培养在发酵罐或圆锥罐内，通过不断通气搅拌或振荡，使菌体在液体深层处繁育的方法。它能在短期内获得大量的菌体和代谢物，深层发酵是现代发酵工业的主要生产方法。 微生物深层发酵又称液体培养或液体发酵，其原理是在发酵罐或三角瓶中，采用液体培养基，通入无菌空气并加以搅拌或振荡，增加培养基中溶氧含量，提供微生物呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，使微生物在液体深处生长繁殖，从而获得大量的菌体和代谢产物。 1.3 大肠杆菌蛋白质表达系统概述 1.3 表1-1 大肠杆菌表达外源基因的优势 优点 缺点 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 基因克隆表达系统成熟完善 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 细胞周质内含有种类繁多的内毒素 1.3.2大肠杆菌作为外源基因表达受体的原理 大肠杆菌表达外源基因需要许多必须的元件。 对于一个完整的表达载体来说除了插入的外源基因外，还应该包括复制的起点，选择性筛选标志，驱动子及转录终止子。目前构建了多种表达载体，一般对原核表达载体的要求是1转录起始必须的启动子。由于真核基因的启动子不能为大肠杆菌所识别，因此在表达真核生物的基因时，必须将该基因编码区的序列置于大肠杆菌多聚酶所能识别的启动子控制之下。2外源