光引发聚合改性明胶用于牙组织工程可能性初探.docVIP

光引发聚合改性明胶用于牙组织工程可能性初探 　　[摘要]目的研究光引发聚合改陛明胶水凝胶的表征，理化性质以及生物相容性，为牙髓再生引入一种可能的新型复合支架材料。方法甲基丙烯酸将明胶改性后形成甲基丙烯明胶，用核磁共振技术检测其表征，用扫描电镜观察表面形貌，甲基丙烯明胶溶液加入艳固佳2959型光引发剂，经紫外光辐照后形成水凝胶，用流变仪测量黏弹性来反映力学性能，用台盼蓝染色法和CCK-8法检测水凝胶对人牙髓细胞增殖的影响。结果 　　甲基丙烯酸改性明胶增加了明胶机械性能和孔隙率的同时，能够支持人牙髓细胞生长。结论甲基丙烯明胶水凝胶有望成为人牙髓再生研究中一种有潜力的支架材料。 　　[关键词]改性明胶；光引发聚合；牙髓细胞；支架材料；组织工程 　　[中图分类号]R782 [文献标志码]A [doi]10.7518/gjkg.2015.03.005 　　组织工程化牙髓牙本质复合体常用的支架材料有羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）-磷酸三钙（tricalcium phosphate，TcP）、纳米碳化硅（silicon carbide，sic）增强HA复合材料，明胶、胶原、甲壳素等，三维支架为新生组织提供了生长空间，支持细胞生长，增殖并模拟胞外基质的许多功能。明胶被广泛用作生物医用材料，但其凝胶性不耐久，35℃以上即溶化为溶胶态。如果利用明胶侧链基团反应活性高的性质，将丙烯酸类单体接枝到明胶分子上，就可在正常体温条件下长时间保持明胶的凝胶形态。甲基丙烯酸（methylacrylic acid，MA）改性后的明胶在紫外光和光引发剂共同作用下可生成水凝胶，是软骨组织工程研究中使用的一种支架材料，这种可注射光引发聚合水凝胶材料能够自我塑形，用于填充形状和尺寸各异的组织缺损，造成的创伤小，能使得细胞均匀分布在支架材料内部呈三维立体生长，提供仿生的环境，水凝胶含有大量的水分可支持营养物质和细胞代谢产物的交换。因此本研究以人牙髓细胞（human dental pulp cell，hDPC）为对象，研究光引发聚合甲基丙烯酸改性明胶（gelatin methacrylate，GM）水凝胶是否有作为牙髓再生支架材料的潜能。 　　1.材料和方法 　　1.1材料 　　A型明胶（acid-processed gelatin，G）、94%MA、艳固佳2959型光引发剂（Sigma公司，美国），透析袋（Biosharp公司，美国），a型改良伊格尔培养基（modi-fied eagles medium of alpha type，u-MEM）、改良杜氏伊格尔培养基（dulbeccosmodified eagle medium，DMEM）（Hyclon公司，美国），胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）（Hyclon公司，美国）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（武汉博士德生物工程有限公司），青霉素-链霉素、I型胶原酶、分散酶、0.25%胰酶（Gibco公司，美国）；细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）-8（Kumamoto公司，日本）；台盼蓝染液（Sigma公司，美国）；平底六孔培养板（Nunc公司，美国）。紫外光交联仪（Hoefer公司，美国）；冷冻干燥机（北京博仪康公司）；ACE200型200MHz高分辨率超导核磁共振（nuclear magneticresonance，NMR）仪（Bruker公司；德国）；扫描电子显微镜（scan-ning electron microscope，SEM）（FEI公司，荷兰）；旋转流变仪（Haake公司，德国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；倒置荧光显微镜及照相系（Olympus公司，日本）。 　　1.2方法 　　1.2.1合成GM将1g G与10 mL PBS溶液混合，在50℃恒温条件下搅拌20 min以上直至明胶完全溶解，再缓缓加入浓度为94%的MA 1 mL，继续在50℃条件下搅拌，反应持续1 h。随后加入10℃的PBS溶液40 mL，充分混合后置于截留相对分子量为（8-14）×103的透析袋中，在40℃条件下用双蒸水透析1周。透析后的溶液用液氮迅速冷冻后，真空冷冻干燥机冻干处理1周，密封保存于-80℃。 　　1.2.2分析GM 1）NMR：取0.5 mg GM、G和MA分别溶于D.0，用高分辨率超导NMR检测三者的结构构象，并对比。2）SEM：分别扫描GM的断面和表面，观察其表面形貌。 　　1.2.3制备GM水凝胶用60℃的PBS将GM配成质量分数10%的溶液，0.02 um滤器过滤除菌后，转入超净台内操作。取10 mL该溶液，加入50 mg光引发剂充分混匀，配成GM水凝胶准备液。取1 m