荧光蛋白质免疫印迹—入门指南.PDF

操作说明 iBright FL1000成像系统 荧光蛋白质免疫印迹— 入门指南 蛋白质免疫印迹是生命科学研究中的一项重要技术。尽管 优化的荧光检测注意事项 大多数生命科学研究者采用化学发光底物进行检测，但由于 开始使用荧光免疫印迹时，需要对一些试剂和步骤进行优 对多重分析的需求不断增加，现在越来越多的科学家正在 化，以保证背景荧光不会干扰到目标蛋白质的检测。以下为 使用荧光检测法。随着先进的数字成像仪器，如Invitrogen™ 开始时的一些操作建议： iBright™ FL1000成像系统的推出和荧光偶联技术的改进，现 • 含有溴酚蓝的样品缓冲液会发出荧光，可能会增强背景荧 在科学家们已经拥有利用一系列荧光染料和抗体来进行免 光。建议考虑使用不含溴酚蓝的荧光相容性样品缓冲液， 疫印迹检测的必备工具。这些进步不仅为进行荧光检测提供 ™荧光相容性样品缓冲液（货号LC2570）。 如Invitrogen 了便利，而且成本下降、灵敏度提高。总体而言，荧光检测法 和化学发光检测法的免疫印迹流程类似，两种方法各有优点 （表1）。在此我们向您分享我们关于荧光免疫印迹的实践经 验，助您成功使用荧光免疫印迹。 建议：如果使用含有溴酚蓝的样品缓冲液，则可在转 印前使染料前沿与凝胶分离开或在转印后从印迹膜 上切下染料前沿，以防止产生背景荧光信号。 表1. 免疫印迹检测技术对比 化学发光 荧光 信号源 酶促反应的间接信号 荧光基团的直接信号 信号持续时间 较短（几分钟到几小时） 较长（几天到几周） 灵敏度 优异，可用底物种类多样 良好，但可能需要更高浓度的二抗 一致性 印迹间可能存在差异 印迹间的重复性较高 检测 胶片和成像仪器 需要带有合适光源和滤光片的成像仪器 定量 单通道检测使标准化较为困难 带有内部对照的多重分析技术使标准化较易实现 其他注意事项 • 相似分子量的靶点需要进行剥离和印迹的重新检 • 需要注意避免荧光背景 测 • 由于少量的激发光会穿过滤光片，因此曝光时间更长会导 • 曝光时间可以较长，因为捕捉信号时不需要激发 致背景荧光较高。 光源 • 建议减少凝胶中上样的分子量标记物的数量。可使用标准 • 建议只使用经过过滤的高质量缓冲液，如Thermo 的预染分子量标记物，但是如果标记物包含荧光条带，则 ™ ™ Scientific Blocker FL荧光封闭缓冲液（货号37565）。因 需对上样量进行优化，因为过度上样会增强背景荧光并增 为漂洗和封闭缓冲液中的微粒和污染物可能会遗留在膜 ™ ™ 加对邻近泳道的信号渗透。Invitrogen iBright 预染蛋白 上并产生荧光伪迹。另外，在封闭去污步骤中最好不要使