准种检测及相关实验技术.doc

HBV准种及相关检测实验技术 韩 军 M 同济医院感染科 摘要：乙型肝炎病毒( HBV) 以准种形式存在于宿主体内 HBV准种的变化影响患者的临床表现及疗效，从准种角度了解进化特点以及准种与耐药发生的关系将有利于预测疗效克服耐药以及研发新的抗病毒治疗手段等 HBV准种的实验诊断技术水平直接关系到HBV准种的研究进展，高敏感性和高特异性的准种实验诊断方法的引入将对HBV准种的研究具有重要意义。 关键词:乙型肝炎病毒； 准种； 实验诊断 准种（quasispecies）是由艾根（Eigen）首先提出用于描述同种生物遗传异质性的概念，它特指不同病毒种群间有一定基因序列差异即基因异质性（差异一般不超过核苷酸序列总长度2%～5%），但尚不构成病原体不同基因型或血清型的现象。自然状态下，准种通常由一种或几种主序列以及一系列变异序列组成，当选择压力平衡时可维持相对稳定。乙肝病毒（HBV）具有的准种特性可能是引起乙型肝炎慢性化和抗病毒治疗失败的一个非常重要的病毒学因素。HBV准种概念的提出，为全面认识HBV提供了新的角度，使人们对HBV存在状态的认识产生了两个重要的飞跃：从单一病毒到病毒群的飞跃以及由静态到动态变化的飞跃。 1.HBV准种特点 随着研究的深入，人们逐渐发现HBV准种具有以下特点: 1.HBV准种普遍存在于CHB患者体内。2.HBV准种指的是一个病毒群体而非单一的病毒，各病毒之间遗传同源又存在微小差异 。3.HBV准种病毒间的微小差异可见于HBV全基因序列，以HBVC区S区核心启动子等免疫攻击主要靶位尤为多见 。4.HBV存在cccDNA池和RC-DNA池( relaxed circular DNA) 两个准种群。5.外界环境变化时HBV准种中的劣势病毒群可漂变为优势病毒群。6.疫苗和抗病毒药物的使用不会抑制HBV准种的形成，只会加速HBV的突变和进化。7.HBV准种与乙型肝炎慢性化肝癌的发生HBV免疫逃逸HBV耐药等密切相关。由于HBV准种的以上特点，人们在近年来疾病转归耐药克服和更合理的抗病毒治疗方案的研发中更加关注HBV准种现象。 2.HBV准种与临床 目前常用的抗病毒药物主要有拉米夫定阿德福韦酯恩替卡韦替比夫定等，其中拉米夫定5年耐药率可达60%～70%［1］，拉米夫定耐药后常采用联合阿德福韦酯或恩替卡韦治疗［2］，恩替卡韦治疗5年的基因型耐药率为1.2%，临床耐药率为0.8%［3］。HBV耐药除了与HBV RT区相关外，Chen等［4］还发现，HBVS C基因中决定T细胞和B细胞表位的核苷酸变化可导致耐药 Moriconi 等［5］指出，拉米夫定单一治疗产生的HBV准种现象会影响阿德福韦酯治疗疗效，并降低病毒对其他核苷酸类似物的敏感性 外界压力下，准种中的劣势病毒群不一定完全消亡由于基因漂变的作用，原有耐药株在补救治疗中成为劣势病毒群后仍有可能累积成优势病毒群［6］。在一些补救治疗或序贯疗法中，短时间内HBV野生株可替代耐药株成为优势株，但提高扩增效率仍可检测到耐药株，随着治疗的持续，原耐药株仍会被筛选出来，甚至会在原有耐药株基础上出现交叉耐药株和多重耐药株而导致治疗失败［7］。 虽然，HBV耐药是无法逆转的，但在耐药发生前能够预测 Pallier等［8］发现一些耐药性突变在发生病毒学突破前几个月就能检测出来，耐药性突变随着抗病毒治疗的进行而逐渐演化，最终转变为优势病毒群而导致治疗失败 有研究表明，抗病毒治疗4周时HBVRT区的准种变化一定程度上可以预测拉米夫定或恩替卡韦的治疗疗效［9-10］.HBV准种群中优势准种决定药物的敏感性，劣势准种储备耐药潜力［11］，临床上若将HBV优势种群与抗病毒药物敏感性联系起来，将有利于患者的个体化治疗。因此，在抗病毒治疗过程中对准种的动态监测相对于单纯的HBVDNA定量检测具有更重要的临床应用价值。 准种的动态监测打破了抗病毒治疗管理的常规思想，它可以早期预测抗病毒疗效，有效的准种动态监测和治疗干预一定程度上能避免耐药株的积累 由于一些决定HBV T细胞B细胞表位的核苷酸变化也可导致耐药，抗病毒治疗过程中的准种的动态监测不应仅局限于HBV RT区，对HBV基因全长的准种的动态监测似乎更为合理，而对准种的动态监测也主要包括准种的复杂度多样性以及进化率等方面. 3.HBV准种常用实验诊断方法 当前，特异性好敏感性高的准种检测方法对于克服HBV相关问题有重要意义，常用的检测手段主要有以下几种: 3.1 直接测序法 该法是检测病毒突变的金标准，对聚合酶链反应( polymerase chainreaction，PCR) 产物进行直接序列分析，并与DNA序列进行对比 该方法检测结果可靠，但是费时费力费