植物乙醇酸氧化酶的纯化和特性.ppt.pptVIP

植物绿叶中乙醇酸氧化酶(GO)的纯化 GO酶特性 GO酶纯化 绿叶加缓冲液捣碎(取粗蛋白，绿色) 羧化酶通常和色素结合在一起,呈现绿色 绿叶加入磷酸缓冲液（pH8.0），捣碎和过滤。滤液为深绿色。其中含羧化酶、叶绿素和GO酶等 10%HAC调至pH5.3，放置5min后离心。 15%-35%硫酸铵分部沉淀： 去部分杂蛋白（疏水性强和弱的蛋白） 15硫酸铵沉淀后，离心要上清 上清继续调至35%硫酸铵沉淀，离心要沉淀 Seohadex G-50 分子筛层析：去小分子蛋白和盐，获得高分子量的GO酶 GO酶加FMN辅酶，采用pH8.3的电泳缓冲液（流动相），上DEAE-纤维素阴离子交换柱层析 SDS鉴定纯化效果 * * * * 研究创新型实验 -植物乙醇酸氧化酶的纯化和特性 ? pI9.6,亚基分子量为40kDa ? 以FMN(黄素嘌呤核甘酸)为辅酶 提取时加入FMN有利于酶的稳定 ? 盐析范围在15%-35%硫酸铵饱和度中 ? 叶片中羧化酶占60%，其等电点为5.3 pH5.3沉淀(等电点沉淀去除羧化酶) 绿色变为黄色 15%- 35%硫酸铵分步沉淀(去杂蛋白，小分子蛋白) Sephadex G-50柱层析(脱盐和去小分子蛋白) DEAE-纤维素阴离子交换层析（分离高pI的GO酶) 去掉了羧化酶！ 加硫酸铵后变混浊（疏水性强的蛋白），离心