水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定-Bio-protocol.PDFVIP

/e1010162 DOI:10.21769/BioProtoc.1010162 水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 Determination of Superoxide Dismutase (SOD) Activity in Rice 都浩，王妮丽，熊立仲* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：lizhongx@ 引用格式：都浩，王妮丽，熊立仲. (2018). 水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定. Bio-101 e1010162. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010162. How to cite: Du, H., Wang, N. L. and Xiong, L. Z. (2018). Determination of superoxide dismutase (SOD) activity in rice. Bio- 101 e1010162. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010162. (in Chinese) 实验原理：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是一种清除超氧阴离子自由基 的酶，逆境环境导致超氧阴离子自由基的积累，诱导植物体内产生SOD。本实验依据超 氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质 存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离 子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大 吸收峰。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后， 反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 实验目的：检测水稻受到生物逆境处理后，体内超氧化物歧化酶(SOD)活性及清除活 性氧的能力。 关键词：水稻，氮蓝四唑(NBT)，超氧化物歧化酶SOD，生物逆境 材料与试剂 1. 样品袋 2. 冰盒 3. 10 ml 离心管 4. 2 ml 离心管 5. 遮光物 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010162 DOI:10.21769/BioProtoc.1010162 6. Na HPO (天净光复科技发展有限公司) 2 4 7. NaH PO (天净光复科技发展有限公司) 2 4 8. 甲硫氨酸 (Met) (武汉创新生物技术有限公司, catalog number: BA1081) 9. EDTA-Na2 (生工生物, catalog number: E0105-500g) 10. 氮蓝四唑 (NBT) 11. 0.05 mol/L 磷酸缓冲液 (见溶液配方) 12. 130 mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液 (见溶液配方) 13. 750 µmol/L氮蓝四唑溶液 (见溶液配方) 14. 100 µmol/L EDTA-Na 溶液 (见溶液配方) 2 15. 20 µmol/L核黄素溶液 (见溶液配方) 仪器设备 1. pH 试纸 (Sigma, catalog number: P-4536)或pH 计(Satorius, catalog number: PB-10) 2. 剪刀 3. 研钵 4. 冷冻离心机 (Eppendorf, model: centrifuge 5417R) 5. 分析天平 (Adventurer, USA) 6. 分光光度计 (BECKMAN DU® 640 Spectrophotometer) 实验步骤 1. 水稻组织样品准备，到温室或田间取样，立即放置于样品袋中，存放于冰盒中带 回实验室。 2. 酶液提取 在天平上迅速称取水稻组织0.3-0.5 g，剪刀剪碎到预冷的研钵中，加1 ml预冷的 磷酸缓冲液，在冰浴上研磨成浆，研磨过程中补加缓冲液使终体积为4 ml 。将研 磨液倒于10 ml离心管中，4 °C 5,000 x g离