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色谱分离法 第一节 概述 色谱法简介 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。 在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相； 自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相； 装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱 。 3.按照展开程序分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法和迎头法。 洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图。 这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。 顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图。 此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。 第三节. 生物工程中色谱分离 电泳和色谱是目前两种最好的分离方法 电泳不能用于生产规模 一 色谱的分离规模 1. 色谱分析：?10mg 2. 半制备（中等规模制备）：10-50mg 3. 制备（样品制备）：0.1-10g 4. 工业生产：?20g/d 干扰素：1万元/1mg，年产值达1亿元 （二）色谱分离方法的选择 初级代谢产物 氨基酸、核苷酸、单糖类、脂肪酸 次级代谢产物 生物碱、糖苷、色素、抗生素 生物大分子 蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖等 第四节. 色谱分离的基本原理 各组分和固定相存在一定的化学亲和力 移动速度低于流动相 各组分和固定相的亲和力大小不同 各组分移动速度不同 展开（Development） 洗脱液（Eluate） 色谱（Chromatography） （一）分配色谱 （一）分配系数K和分配比k 1. 分配系数K 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。 它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 K=溶质在固定相中的浓度 / 溶质在流动相中的浓度 = Cs / Cm 分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 2. 分配比 k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 k = 组分在固定相中的质量 / 组分在流动相中的质量 = ms/mm k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。 k = ms/mm =CsVS/CmVm 式中cs,cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。 例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。 分配比 k 值可直接从色谱图中测得 k = (tr–t0 )/t0 = t?r/t0= V?r/V0 4. 分配系数K与分配比 k 的关系 K = k .? 2 色谱法分类　　 2.1 按色谱过程的机理分类吸附色谱：利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和