毕业论文(设计)-《醋酸纤维薄膜电泳实验》.docVIP

w 醋酸纤维薄膜电泳实验 [关键词] 醋酸纤维薄膜；电泳；影响因素；对策 [key words] cellulose acetate membrane; electrophoresis; influencing factors; countermeasure 醋酸纤维薄膜电泳因其有快速省时、分辨能力强、操作简单、成本低廉、透明后利于扫描定量及长期保持等优点，被广泛应用于血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子的分析检测，已成为医学和临床检验的常规技术，血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验也成为了生物化学实验课程必开的基础实验项目之一。但该实验影响因素很多，每个环节的失误都会对实验结果产生影响而得不到理想的图谱，并且还造成很大浪费。笔者结合多年的实验教学经验对影响本实验结果的常见因素进行分析探讨，并提出了相应的解决对策。现报道如下： 1 电泳前准备的影响因素 1.1 醋酸纤维薄膜的因素 1.1.1 醋酸纤维薄膜的选择 醋酸纤维薄膜如果厚度不一、粗面细孔不均、脆性不一，在电泳时会出现区带不均匀、白色斑点处蛋白质不泳动而影响图谱的效果[1]。对策：①购买知名度相对高的正规厂家生产的产品；②将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，如漂浮20 s左右时，膜片出现白斑点或条纹，应舍去不用[2]。 1.1.2 醋酸纤维薄膜的浸泡 由于醋酸纤维薄膜亲水性比较低，浸泡时间过短，不能保证膜片上有一定量的缓冲液，难以使其恢复原来多孔的网状结构，所以浸泡时间不少于30 min。浸泡时用镊子将纤维薄膜条粗面向下平稳放入缓冲液中，使其自然湿润沉下液面或用手轻摇装液外盒，不要用镊子、玻棒等器材按压纤维素薄膜沉下液面，也不要同时将多条纤维素薄膜一起放进缓冲液盒。 1.2 标本的因素 1.2.1 血清标本的新鲜度 不新鲜血清标本蛋白质电泳图谱α2与β之间可能会多出现一条粗而染色均匀的区带，也可能会出现电泳图谱区带不清晰，比较离散，甚至有拖尾现象[1]。有研究证明，在2～8℃冰箱保存血清标本，第1天与第2天标本中各蛋白质组分百分比变化无统计学意义，从第3天开始，标本中白蛋白百分比下降，α1-球蛋白、α2-球蛋白和β-球蛋白百分比上升均有统计学意义[3]。因此，必须使用新鲜的血清，如新采取血清标本不是马上用，则必须放4℃冰箱贮存保鲜，但时间最多不能超过48 h。 1.2.2 溶血标本 溶血标本中白蛋白降低，α2-球蛋白、β-球蛋白升高。严重溶血时可见α2、β球蛋白区带重叠，区带百分比增加[4]，因此应采用清亮无溶血的血清标本。 1.2.3 点样标本的替代 有文献报道，在实验教学中用鸡蛋白（鸡蛋清∶缓冲液=1∶9）代替血清作为点样样品，加样量约3 μl，可取得卵转铁蛋白、卵白蛋白、溶菌酶和卵黏蛋白4条电泳区带[5]。用鸡蛋白作为实验材料，既取材方便，又能节约成本。 1.3 缓冲液的因素 1.3.1 缓冲液的离子强度及ph值 缓冲液的离子强度应为0.06，ph应为8.6。如离子强度过低缓冲容量小，不易维持缓冲液的ph值恒定，同时导致样品所载电流增加，电泳速度加快，带电颗粒在介质上扩散严重，分辨力明显降低，区带展开延长，导致区带拖尾[6]。ph过高、过低也会影响实验结果。研究证实，随着电泳次数的增加，巴比妥缓冲液的ph发生变化，且阳极变化明显，导致电流强度、蛋白迁移率、蛋向区带均变小，故巴比妥缓冲液实验6次左右就应更换，否则会发生明显拖尾现象[7]。对策：①选择没有失效的分析纯药品；②用电子天平准确称取药品，精确到0.001 g；③配好后用ph计校正；④学生多次使用时，应在每次电泳前将正负两极的缓冲液混匀再分别加入电泳槽两极，保证缓冲液ph值稳定或重新配置新的缓冲液。 1.3.2 缓冲液的替代 巴比妥缓冲液中巴比妥有毒性，长期接触会对人体产生伤害，且实验教学中大量使用费用较贵。有实验证明，用硼酸缓冲液（离子强度：0.08；ph 8.6）代替巴比妥缓冲液能得到更清晰、更理想的电泳图谱[8-9]。硼酸缓冲液连续电泳实验10次蛋白仍可分离清晰，这样既减少了避免了巴比妥对操作者的伤害，又减少了成本。 1.4 点样的因素 点样是本实验关键的一步，点样前薄膜的准备、点样器的选择、点样位置的选择、点样的量的多少都直接影响最后图谱的效果。 1.4.1 点样前薄膜的准备 浸泡好的薄膜吸得过干，电泳时电流不易通过薄膜，样品在薄膜上流动困难，易导致电泳图谱有条痕；亦不能留存过多的缓冲液，以避免点样时血清随着缓冲液而扩散开来，导致电泳图谱分离不齐[10]。因此只要用滤纸轻轻吸取薄膜上的多余水分即可。 1.4.2 点样器的选择 传统用载玻片端面点样，因其宽度稍大于薄膜宽度，点样血清会横跨薄膜，产生明显的边缘效应，且有拖尾现象。有文献报道，用自制点样器（将宽为1.3 cm的订书针折成0.4