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生姜蛋白的生物大分子修饰
报告人: 西安交通大学 申世红 材料与试剂: 生姜(市售鲜生姜);单甲氧基聚乙二醇(mPEG5000);右旋糖苷(dextran40000);三聚氯氰(C3Cl3N3);高碘酸钠;2,4,6- 三硝基苯磺酸 (TNBS);硼氢化钠;聚乙二醇(PEG20000) 仪器与设备: PHS-3C 精密pH 计;THZ-82 型数显式电热恒温水浴锅 厂;HJ-3 型数显恒温磁力搅拌器;TU-1810 紫外- 可见分光光度计 LGJ-18A 型冷冻干燥机 方法: 生姜蛋白酶的制备: 1.将新鲜生姜洗净、切丁,每1kg 生姜加入4℃预冷的磷酸缓冲液2L。用高速组织捣碎机搅碎制成匀浆,离心弃渣取上清液。 2.将离心姜液进行超滤处理,得到相对分子质量大于10000、小于50000 的生姜蛋白酶浓缩液。将生姜蛋白酶浓缩液与4℃预冷的丙酮按一定的比例混合(数据来源于本文参考文献),离心弃上清液,取沉淀自然风干,制得生姜蛋白酶粗粉。 3.将生姜蛋白酶粗粉用磷酸缓冲液溶解后,经葡聚糖凝胶G-200 和二乙氨基乙基纤维素DE52 进行两次柱层析纯化,透析脱盐后经冷冻干燥得到生姜蛋白酶纯品 生姜蛋白酶活力的测定 原理: ?生姜蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸,在碱性环境下,酪氨酸与福林试剂作用产生有色物质,于波长660nm 处进行光密度(OD)测定。 ?光密度与酪氨酸的浓度成正比。 ?酪氨酸的量来表示生姜蛋白酶分解蛋白质的能力。 (在这里笔者定义:在40℃、pH6.0 条件下,每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸,定义为1 个蛋白酶活力单位。具体测定方法参见SB/T 10317 — 1999《蛋白酶活力测定法》。) 单甲氧基聚乙二醇对生姜蛋白酶的修饰 单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的活化: 采用三聚氯氰活化法[7-8](此处笔者仅提供了参考文献) 活化mPEG 化学修饰生姜蛋白酶的制备: ?在酶液质量浓度为2.0mg/mL 的生姜蛋白酶硼酸缓冲液中,加入一定比例的活化mPEG 修饰剂,于40℃水浴中保温反应lh; ?磷酸缓冲液(0.lmol/L,pH7.0)中透析24h,用截留相对分子质量为10000 的超滤膜超滤,截留浓缩液,冷冻干燥即得mPEG 修饰的生姜蛋白酶。 ?。通过酶修饰率和修饰酶的活力测定,探讨活化mPEG 的用量和pH 值对修饰效果的影响。 * * Company Logo Company Logo 生姜蛋白酶的大分子结合修饰 作者:刘恩岐,张建萍,贺菊萍 文章来源:生物谷 生姜及生姜蛋白酶的简介 生姜蛋白酶:是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶,它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性,被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。 应用: 医药工业;食品工业; 日化工业;饲料工业; 皮革工业 生姜蛋白酶 生姜及生姜蛋白酶的简介 文章背景知识: 1.天然生姜中蛋白酶的缺点:稳定性差、失活快,限制了生姜蛋白酶在生产中的推广应用。 2.修饰方法:大分子结合修饰是目前应用最广的酶蛋白修饰方法之一,对提高酶活力、增强稳定性具有显著效果。 3.常用的修饰剂: ?聚乙二醇:聚乙二醇(PEG)是一种线性、无毒且不带电的水溶性大分子。 ?右旋糖苷:由D- 葡萄糖通过α-1,6 糖苷键连接而成的高分子多糖,具有良好的生物相容性和水溶性 。 文章结构 文章结构 材料与方法 结果与分析 结论与讨论 第一部分:材料与方法 第一部分:材料与方法 材料与方法:生姜蛋白酶酶活力测定 材料与方法:单甲氧基聚乙二醇对生姜蛋白酶的修饰 材料与方法:右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰 右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰 右旋糖苷的活化: 采用高碘酸钠活化法(此处笔者仅提供了参考文献) 活化右旋糖苷化学修饰生姜蛋白酶的制备: ?在酶液质量浓度为2.
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