连接年分生物学实验.pptVIP

电泳分析定量计算定量结果：确认回收片段，测定浓度并计算回收量。 制胶: 四人一块胶，1%琼脂糖凝胶，20ml 上样电泳: 1. Marker 5uL （0.75ug） 2. 5.3Kb 2uL 3. 0.7Kb 4uL （注意：样品加入10x loading buffer混匀后再上样) DNA连接酶 将具有相同粘性末端或平端的DNA分子连接起来。 DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。 T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子 特点： 催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。切口(nick)：DNA分子糖-磷酸主键的破坏。缺口(gap)：DNA分子中核苷酸缺失。 DNA连接酶： T4噬菌体DNA连接酶（可连接平末端双链DNA） 大肠杆菌DNA连接酶 连接酶单位： Weiss单位（ppi单位）：37?C、20分钟内将1nm的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上. １个Weiss单位相当于60个粘端单位 反应温度：最佳温度37°C 一般采用4-16 °C 4.1.3 影响连接反应的因素 反应温度 连接酶的用量 DNA末端的性质 DNA浓度及两种DNA分子数的比例 外源DNA末端的性质 带有不同突出末端的片段 双酶切：末端不同；可定向连接 带有相同突出末端的片段 单酶切：末端相同;大量无效连接产物 如载体自环化，引起转化子高本底 解决办法：5’末端去磷酸化 （CIP小牛肠碱性磷酸酶） 利用CIP防止载体DNA的重新环化 4.1.4载体、供体浓度及比例 通过控制插入片段与载体之间的比例以达到最大效率的重组连接。 最佳比例是由构造及末端的类型决定的。 一般需要较高的插入片段与载体的摩尔比例。 如2：1 甚至4：1，今天我们采用3：1 插入片段与载体的DNA的最适总浓度：一般载体用100ng,插入片段用量根据比例计算确定。 4.2.1实验材料 pET28a BamHI-NotI 酶切质粒载体片段。 eGFP BamHI-NotI 酶切目的片段。 T4DNA连接酶 其它 * 实 验 三 DNA片段的回收（续） 取上一实验回收的无水乙醇沉淀的DNA管。 12000rpm离心10mins，弃上清。 用75%乙醇0.5ml洗涤沉淀，12000rpm离心2mins，弃上清。 空气干燥10mins 加入10uL TE 溶解回收产物。 分别标记组号，注明5.3kb 或0.7kb 电泳定量 沉淀和溶解 2.2.4 观察结果 计算公式: 待测样品的DNA量(ng) = Marker DNA总质量 同等亮度条带的Marker的bp数 Marker各条带bp数总和 X DNA片段的重组（连接反应） 实 验 四 背景理论知识 Section 1 BamHI NotI pET28a 5.37kb BamHI（661） NotI（1398） pEGFP-N3 4.7kb EGFP(720bp) EGFP(720bp)-BamHI-NotI pET28a(5.3kb)-BamHI-NotI Ligation 4.1.1 实 验 目 的 学习克隆工作中常用的单、双酶切，载体去磷酸化处理等连接方法 了解反应中各因素对连接效率的影响 4.1.2【实验原理】 DNA重组：在DNA连接酶的作用下,在含有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接,获得重组DNA分子。 T4DNA连接酶：ATP是辅助因子； 大肠杆菌DNA连接酶NAD+是辅助因子。 4.1.2【实验原理】 4.1.2【实验原理】 定向克隆 返回 4.1.4载体、供体浓度及比例 重组DNA片段摩尔比例的换算： 100ng pET28a (5.3kb) ：100ng eGFP(0.7kb） =？ 1 : 7.5 实验操作 Section 2 *