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第四章 循环水微生物监测分析 第一节 异养菌的测定—平皿计数法 1.适用范围： 本法适用于原水、生活用水、工艺循环冷却水中异养菌的测定。 2.方法原理： 利用平皿计数技术在29±1℃培养72h来测定水中异养菌总数。 3. 试剂与材料 3.1 培养基制备所需试剂，使用生化试剂或分析纯试剂 3.2 生理盐水：0.85% 3.3 乙醇溶液：755（V/V） 3.4 医用脱脂棉 3.5 医用纱布 3.6 牛皮纸、绳、皮筋 4.仪器: 4.1 SW—CJ—IF型净化工作台 4.2 蒸气压力灭菌锅 4.3 生化培养箱/隔水式电热恒温培养箱 4.4 电热干燥箱（温度可控制在60~280±2℃） 4.5 刻度吸量管：1mL 4.6 培养皿 490mm 4.7 三角瓶：250mL 4.8 试管 10×100mm 4.9 称量瓶 5.准备工作: 5.1 营养琼脂培养基的配制: 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1L 先取1L 蒸馏水于2000mL烧杯中，依次加入适量牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂后，加热溶解至透明后取下，趁热经四层厚的纱布过滤到另一个洗干净的大烧杯中，用0.1mol/L的NaOH溶液调其PH值约7.5左右，然后分装在洗净的锥形瓶中，每瓶约150mL，用纱布包好的脱脂棉塞子塞紧瓶口，然后用牛皮纸包住瓶口，用绳子扎紧，放入蒸汽压力灭菌锅中消毒，达到0.15MPa（即121℃）后继续加热灭菌半小时即可。 5.2 稀释水（生理盐水）的配制： 将8.5g氯化钠溶解在1L蒸馏水中，此溶液浓度为0.85%。将配制好的生理盐水用吸量管转移到用蒸馏水清洗干净的试管中，每管均为9.0mL，管口用纱布包的脱脂棉塞子塞紧，六根试管放在一起用牛皮纸包为一捆用绳扎紧，竖直放置。高压消毒同5.1。 5.3 移液管灭菌: 用蒸馏水洗净的吸量管用75%乙醇冲洗内壁后，再用净纸（或报纸）将每支管子独立包装，放入烘箱中160℃灭菌2h，备用。 5.4 培养皿灭菌: 用蒸馏水洗净的培养甲，再用75%乙醇擦洗内壁和外部，9个一组，用报纸包扎，放入烘箱中160℃灭菌2h，备用。 5.5 采样瓶的灭菌：同亚硝酸细菌测定中5.4 6.操作步骤: 6.1 水样采集: 将水样彻底搅动均匀，方法是上下（或前后）摇动25次。摇动的幅度大约0.3米，所花的时间为7秒钟，其余同铁细菌的测定中6.1。 6.2 净化工作台灭菌 将已经高温高压灭菌的生理盐水、培养基、1mL吸量管、培养皿取样三角瓶适量放入净化工作台中紫外线灭菌30min。 6.3 先将培养基融化后置于45±1℃的水浴中保温，到了使用之前才能取出。若发现培养基中含有沉淀物就应该弃去不用。 6.4 检验之前，在每个培养皿上标明水样号码、稀释度、日期和其他任何应有的说明。每个稀释度至少要准备两个重复的培养皿。 6.5 水样稀释与接种: 6.5.1 将水样放入灭过菌的净化工作台中，立即用75%（V/V）乙醇溶液浸泡过的医用脱脂棉或纱布擦手，点燃无菌室内的酒精灯。下面操作在净化工作台的火焰区进行。用1mL灭菌吸量管吸取水样1mL注入到9.0mL的空白稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10-1，另取1支1mL灭菌吸量管吸取1mL稀释度为10-1水样注入第二个空白稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10-2。依次做10倍递增，稀释到10-5倍即可。当吸取水样时，不要把吸管尖插入液面之下超过2.5cm深。放出水样时，吸管尖不要触及稀释水。 6.5.2 将每一个稀释度的水样吸取1mL移入灭菌后的培养皿中，管尖端与培养皿底成45°的角度相接，皿盖要适当提起，使吸管恰足以插入，放完后停留2到4秒。移开吸管时不宜再碰到平皿。依次将10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释度的水样分装到培养皿中，每接一个稀释度再换一支灭菌吸管。每个稀释度需做二到三平行。 6.5.3 灌皿：将融化后温度约45±1℃的培养基灌入已移入水样的培养皿中，每个平皿至少10—12mL，灌皿之后要将融化的培养基和其中定量的试验水样彻底混合。方法是握住平皿，先往一个方向画圆，再朝相反方向回转。小心勿使这个混合液体溅到培养皿的边缘。其间所用时间不超过20分钟（最好在10分钟内完成）。让平皿培养基于水平位置静置10分钟左右固化，固化后倒置平皿。 6.5.4 空白对照：将培养基灌入加有1mL空白稀释水的无菌平皿中，作空白对照检查。若空白培养皿出现菌落，表明测定结果有污染，测定无效。 6.6 培养: 在恒温培养箱中于29.8℃培养72±4小时，检查培养基和稀释水的无菌性。 7. 计数与报告: 7.1 培养到期后，取出平皿立即计数，计数应选择那些具有30—30