生物化学技3吸附层析.pptVIP

（三）装柱 1.干法装柱 直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂 此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀 2.湿法装柱 先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图3-5）；待其自然沉淀至柱高的1/4 ~ 1/3 时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用2~3倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡 注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡 （四）上样和洗脱 ①经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品液体积应小于床体积的1/2）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通，分级收集 ②将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成分能完全分离（图3-7） ③为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度下降） ④分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存 加 样 操 作 示 意 图 （五）柱子再生 各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异 * * * * * * 第三章 吸 附 层 析 层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的 层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法 吸附层析（absorption chromatography）又称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法 吸附层析的概念 目 的 掌握 吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法 层 析 方 法 的 类 型 第一节 吸 附 柱 层 析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相制备成色谱柱，以有机溶剂或缓冲液为流动相，用于分离纯化的一种层析方法 吸附柱层析的概念 吸附层析的固定相 极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性：如活性碳等 流动相通常为有机溶剂或缓冲液 一、常 用 术 语 1．固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸附剂、离子交换剂)和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用 2．流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层析中又称为展开剂 3．层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换，最终使混合物得到分离的过程 4．操作容量 是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之 5．床体积(Vt) 是指膨胀后的基质在层析柱中所占有 的体积(Vt)。它是基质的外水体积(Vo) 和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg)的总 和，详见图3-1，即V=Vo+Vi+Vg 6．洗脱体积(Ve) 是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve 表示(见图3-7中OB) 7．外水体积(Vo) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和 8．内水体积(Vi) 内水体积是指基质颗粒内部体积的总和 9．基质体积(Vg) 基质体积是指基质自身所具有的体积。 Vo、Vi和Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的 10．膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（用Vβ表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大 11．分配系数 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示 12.迁移率 指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。常用Rf表示 二、基本原理 利用被分离样品中不同组分与