第四篇 慢病毒实验技术实践操作总结.pdfVIP

慢病毒实验技术实践操作总结 【来源/作者】济宁医学院肿瘤研究中心--李杰 【更新日期】2013-12-30 11:48:37 慢病毒简介 慢病毒载体（Lentivirus Vector ）是以人类免疫缺陷I 型病毒（HIV-1）为基础发展起来 的基因治疗载体。能高效的将目的基因或RNAi 片段导入动物或者人的原代培养细胞或细胞 系中，即将外源性基因有效的、稳定的整合到宿主染色体上，实现所谓“稳定整合”，从而使 目的基因在目标细胞系中持久表达。其区别于一般的逆转录病毒载体的特点是对分裂细胞和 非分裂细胞均具有感染能力。在这里，建议针对如神经元细胞、各种干细胞、心肌细胞等， 通常印象中使用传统的转染手段如脂质体2000 （Lipofectamine2000 ）、Qiagen Effecience transfection 、或者电转等难以实现目标基因或者RNAi 片段有效整合的细胞，采用慢病毒载 体感染的方法，问题将迎刃而解。 目前我们实验室应用的主流转染方法 为什么要用慢病毒实验技术？要解释这个问题，我们有必要来探讨一下现在我们实验 室当前主流的转染方法。 1、Invitrogen 公司生产的脂质体2000 在实验中，我们发现脂质体2000 能够高效的将目标片段整合进细胞。并且，脂质体2000 与目标质粒的融合效率非常高。但是，其细胞毒性是一个不可忽视的问题。特别是在研究目 标基因与抑制肿瘤细胞增殖，或是促进肿瘤细胞凋亡方面。在细胞数量均一化的待处理实验 组中，如果脂质体2000 的量控制不好，会导致细胞在转染后大量死亡(大量圆形死细胞会漂 浮于细胞板中央) ，这对于结果的可靠性和稳定性是硬伤。并且，在脂质体转染的时候， Invitrogen 公司建议采用无血清或低浓度血清的体系下再配合（脂质体2000+ 目标质粒）的 转染。无血清或低浓度血清的培养状态并不是所有细胞都能耐受，会出现一些影响实验进程 的意外情况，如细胞形态改变、细胞脱壁。有些细胞在培养过程中有些黑色自由游动的小颗 粒，在无血清或低血清培养体系中会以蚕食细胞的方式维系自身的生存。所以，咱们经常听 见有同学抱怨说细胞本来好好的，一转染就瞬间爆发这些小黑虫子（杆状细菌）。因此,如 若细胞瓶(板)底部出现黑渣子,或细胞表面出现不光滑的现象,最好不要考虑进行脂质体转染 实验。而感受态细菌含有的内毒素对细胞同样有毒性，因此质粒提取一定要严格使用去内毒 素的质粒抽提试剂盒。推荐qiagen、Invitrogen 公司中抽质粒试剂盒。转染microRNA ，siRNA 时，建议Invitrogen 公司生产的Lipofectamine® RNAiMAX ，转染效率更强。转染过程可选 择消化后转染，随后种板的步骤,使得细胞处于悬浮状态即反转的方式进行，转染效率更佳。 2 、Qiagen Effectene 转染试剂盒 5 a.转染前一天，将细胞以5x10 个细胞每孔的密度接种于6 孔板中（根据细胞类型而定， 标准是第二天细胞的汇合度在60-80 ％）; b 、转染当天，用PBS 或生理盐水（医用级），37℃预热（注：特别针对293 全系、 HK1 、A549 、BMSC 、UC-MSC 、UCB-MSC 、AD-MSC 等对于温度变化敏感的细胞系）洗 两次，再加入新培基，37℃和5 ％CO2 条件下培养2h 左右。（自己预计好实验安排的时间 和设备的调用）。 c、转染当天，取事先溶于TE 缓冲液的DNA （DNA 浓度要求不低于0.1μg/μl 。浓度太 低要反查前面的步骤，单克隆菌落挑取要测序后再进行大量扩增中抽。）取DNA 0.4μg ，用 EC Buffer 稀释至总体积为 100μl。加入3.2μl Enhancer （这里要保证DNA 总量与Enhancer 体积的比例为1μg：8μl），然后振荡混匀。 具体实验用量参看下表。 表格 1：推荐不同规格培养板下转染试剂的用量(引用自Qiagen 公司技术手册) d、将混合物室温（15–25°C ）孵育2-5 分钟，然后快速的离心一下（很多离心机上都 有spin down 的按键，目的就是瞬时离心），以将EP 管顶部的液滴全部收集至管底。 e、在上述体系中加入10μl Effectene，用移液器反复吹吸几次或者涡旋10s。将混合物 置于室温，孵育20mi