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遗传学实验 惠州学院生命科学系 实验一 植物细胞有 丝分裂及染色体制片技术 实验六 利用ISSR分析植物遗传多样性 一、实验目的 1、掌握ISSR技术的基本原理和操作方法； 2、掌握植物遗传多样性分析方法。 二、实验原理 ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术，其基本原理是在SSR的5′或3′端加锚1~4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。重复序列和锚定碱基是随机选择的，扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，每个引物可以产生比RAPD方法更多的扩增片段，因此，ISSR标记是一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的DNA指纹技术。 三、实验材料 水稻或其他植物不同品种或品系。 四、操作步骤：（以水稻为例）。 1准备材料，10-15个水稻品种的种子。 2、种子发芽，提取玉米总DNA（具体操作参见附1）。 3、检测DNA的纯度（具体操作参见附2）。 4、应用ISSR引物扩增玉米DNA（具体操作参见附3）。 5、应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物（具体操作参见附4）。 6、分析实验结果。 ?五、注意事项 ?1、本实验涉及内容较多，请大家认真阅读有关资料，掌握实验原理。 2、本实验所用的一些试剂具有一定的毒性，请大家注意安全。 ?3、本实验所用时间较长，部分实验内容同学可以另外安排实验进行。 六、作业及思考题 ??1、应用ISSR技术分析植物品种遗传多样性应注意哪些因素？ ??2、分析植物品种遗传多样性在遗传学研究上有什么作用？ 附2 DNA浓度的测定 一、实验材料 ??? 所提取的水稻DNA母液。 二、实验器具和药品 1．用具：7522紫外分光光度计、取样器 2．药品：双蒸馏水、TE 三、操作步骤 1．讲解和练习分光光度计的使用方法 2．取20ml提取的核DNA，加入1980ml蒸馏水对待测DNA样品做1:100(或更高倍数的稀释); 3．蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。 4．加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50mg /ml双链DNA，33mg /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。 5．记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: ??????? ??????? dsDNA（mg /ml）=50×(OD260) × 稀释倍数 附3 聚合酶链式反应（PCR）实验 一、基本原理 双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA（模板DNA），单链DNA在互补寡聚核苷酸片段（引物）的引导下，可以利用DNA多聚酶按5`??? 3`方向复制出互补DNA。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的原理类似于DNA的天然复制过程。在缓冲液中有引物、DNA合成底物dNTP存在下，经变性、退火和延伸即可合成产物DNA。经若干个这样的循环后，DNA即可扩增2n倍。具体过程如下： 1、变性：加热使模板DNA在高温（94oC）下变性，双链中的氢键断裂而形成两条单链。 2、退火：使溶液温度逐渐降至50-60 oC，模板DNA即可与引物按碱基配对原则互补结合。 3、延伸：再将溶液反应温度升至72 oC，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP），按5`??? 3`方向复制出互补DNA。 上述三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量即可增加一倍，新形成的链又可成为下一轮循环的模板，经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。 二、实验器材 PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统、加样枪、枪头、离心管。 三、材料与试剂 1）DNA模板：0.1ug/ul水稻DNA，使用前用TE缓冲液或ddH2O稀释10倍置于冰中。 2）4种脱氧核苷酸（dNTP）：4倍dNTP，即1mmol/L dNTP 、1mmol/L dATP 、1mmol/L dCTP 、1mmol/L dGTP 、1mmol/L dTTP 。 3） 50nmol/L 引物： ISSR第808号引物：AGAGAGAGAGAGAGAGC ISSR第812号引物：GAGAGAGAGAGAGAGAA 4）2.5U/ul Taq聚合酶 ?? 5）DNA 标记（Marker） ? 6）10X PCR反应缓冲液：含有500mmol/L KCl、100mm