山东大学研究生国家精品课程_基因工程学原理-工具酶.pptVIP

重组人工粘性末端 DNA1 DNA2 dATP dTTP AAAAA AAAAA TTTTT TTTTT AAAAA TTTTT AAAAA TTTTT dATP dTTP 末端转移酶 * 七、核酸酶 核酸外切酶 RNase RNas H S1核酸酶 * （一） 外切酶III（ExoIII） 1. 一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反应类型 1) 外切酶活性：3’ 5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 3) 3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4 4) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5 * 3. 用途 1)??? 核酸（DNA）标记 2)??? 基因突变----缺失 3)??? DNA序列测定时作顺序缺失 * 5P 5P 5P 5P 5P 3HO 3HO 3HO 3HO 3HO 3HO 3HO 3HO OH3 OH3 OH3 OH3 P5 P5 P5 P5 P5 P5 P5 3HO P5 OH3 P5 RNaseH ExoIII的外切酶和RNaseH的作用 * ExoIII ExoIII [α-32P] [α-32P] dCTP dCTP 5P P5 5P P5 3HO OH3 3HO OH3 ExoIII 用于 DNA 标记 * （二） RNase 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。 1. RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）, 用于除去DNA样品中的RNA分子 2. 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA （三） RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。 * (四）单链核酸内切酶- S1 核酸酶 (p58) 单链特异性核酸酶： 　　降解ss DNA　、ＲＮＡ 　　用于ＲＮＡ分子或内含子定位　 　　降解粘末端及ｃＤＮＡ形成中的发卡结构 * ExoIII S1 S1 S1 S1 S1 S1 Poly(A) Poly(A) 5 5 5 5 5 5 核酸酶S1活性 * 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 * * II型酶的识别序列有什么特点？ 比较三种RE的各种特点？ RE切割后可以产生哪些末端？ 甲基化酶的用途是什么，如何检测甲基化？ 常用DNA聚合酶有哪些？ DNA聚合酶和连接酶的区别是什么？ What should you learn? * * 1942年,C.H.Waddington首次提出表观遗传学(epigenetics)的概念,并指出表观遗传与遗传是相对的,它主要研究基因型和表型的关系。几十年后,霍利迪(R. Holiday)针对表观遗传学提出了更新的系统性论断，也就是人们现在比较统一的认识[1]，即在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见。 定义：与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统: dam甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基: G mATC dcm甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基 : C m