桃小食心虫病原真菌系列.doc

桃小食心虫病原真菌 【摘要】：桃小食心虫(简称桃小)是危害严重的果树食心虫类害虫。可应用病原真菌在土壤中对越冬老熟幼虫感染致病进行生物防治。由于病原真菌能在土壤中长期宿存,被感染的幼虫又作为新的感染源,从而可对桃小的种群数量起到持续控制作用。本文采用从自然染病的桃小越冬虫尸上分离病原真菌的方法,分离筛选出对桃小致病力高的一株病原真菌,对其进行形态学与分子鉴定,确定种属地位。系统地研究了该菌株对桃小幼虫的致病力,侵染桃小的致病过程以及桃小感染后的组织病理学特征和生理生化防御反应。并对该菌株的生物学特性与菌粉的制备,野外防治效果,菌株在自然环境中的宿存情况以及与常用化学杀虫剂的相容性进行了研究,为应用该菌株对桃小进行生物防治提供理论和应用依据。研究结果如下：1.从桃小的越冬虫尸上分离并筛选出一株对桃小致病力高的病原真菌TST05。通过回接实验证实其为桃小的病原真菌。该菌株在PDA培养基上的培养菌落初为白色毛绒状,后产生浓密的黄色粉状孢子。具有白僵菌属典型的特征,产孢轴末端“之”字型弯曲且孢子着生在小齿突上。产孢细胞多浓密簇生,显微镜下可见球状密集的孢子头。分生孢子卵圆形或近球形。应用rDNAITS序列分析方法对其进行分子鉴定。结合形态学和分子鉴定结果确定TST05菌株为白僵菌属Beauveria的球孢白僵菌Beauveriabassiana。2.测定了TST05菌株对桃小老熟幼虫的致病力。结果显示,107-109孢子/mL的孢子悬浮液感染幼虫,9d的累积校正致死率可达到68.57%～97.50%。并且TST05菌株的致死速度较快,染菌2d后幼虫开始死亡,死亡高峰集中于处理后4-7d。随孢子浓度增大,幼虫的死亡高峰时间也随之提前并缩短。致死中时LTso随孢子浓度增加由6.57d缩短至4.31d。致死中浓度LC50从4d的2.16×109孢子/mL降低到6d的4.36×106孢子/mL。研究结果表明,TST05菌株对桃小幼虫有较高的致病力,且致死速度较快,可作为防治桃小的优良菌株。该菌株已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC4526。3.采用光学显微镜、扫描电镜、透射电镜技术,系统地观察研究了TST05菌株孢子在桃小幼虫体表的附着、萌发、菌丝穿透体壁的过程和对内部组织的侵染及其引起的组织病理学变化。研究发现,桃小幼虫头壳硬而光滑,孢子附着很少,但在触角的基部和口器的皱褶处孢子附着较多。在幼虫胸部和腹部,体表着生密集的棘刺和稀疏的长刚毛,孢子主要附着在棘刺基部的体表上。在气门附近和光滑的刚毛上也发现有孢子的附着。孢子萌发后入侵的途径是穿透幼虫体壁。在染菌24-36h,孢子萌发出芽管直接穿透体表或在菌丝前端生成侵入钉侵入表皮。真菌的入侵可破坏原表皮层中的蛋白—几丁质片层结构。在真菌入侵过程中,幼虫表皮中出现黑斑、血淋巴中出现黑化体,显示幼虫体内免疫防御系统作出抵抗反应。真菌进入幼虫血腔后,产生大量芽生孢子并侵入幼虫内部组织器官。观察到脂肪体、消化道、马氏管、肌肉组织的感染症状,以及真菌对幼虫丝腺腔中的丝胶层和液体丝素的侵染和占据过程。最终,菌丝冲破虫尸的体壁,从虫尸内长出并产生新的分生孢子作为新的感染源感染其它寄主。研究结果直观地揭示了TST05菌株对桃小幼虫的感染过程。4.桃小幼虫对TST05菌株感染的生理生化反应试验表明,在受到真菌侵染后,桃小幼虫体内的营养物质海藻糖和蛋白质的含量明显下降,葡萄糖含量先升后降。同时,感染后虫体内海藻糖酶活性升高,5d时达到了对照组的1.91倍。感染后,幼虫体内起免疫防御及保护作用的多酚氧化酶(PO)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性都表现出先升后降的趋势。其中GSTs和GSH-Px受感染影响变化最大,在染菌3d后分别达到对照组的3.84倍和3.95倍。SOD和POD酶活力在感染后3d比对照组高出0.61倍和0.53倍。PO和CarE的活性在感染5d后达到了最高值,分别达到对照组的1.48和1.50倍。表明TST05菌株的侵染,对桃小幼虫的营养代谢产生影响,并诱发了其生理防御反应。染菌后虫体内的过氧化氢酶(CAT)活性始终都低于对照组,最低时仅为对照组的56.78%,显示TST05菌株的入侵对CAT酶有较强的抑制或破坏作用。同时发现,感染TST05菌株可导致桃小幼虫体内乙酰胆碱酯酶(AChE)的酶活性升高,显示该菌株的感染或其代谢毒素可能对幼虫的神经传导有影响。5.测定不同培养基、不同温度和湿度对该菌株的菌丝生长、孢子产量、及孢子萌发的影响。发现该菌株在PDA、PPDA、SDAY、SMAY4种培养基上均生长良好,菌落厚而致密,产孢量均大于3.95×107孢子/mL；菌株适应