第四讲-微生物遗传（课件）.pptVIP

酵母双杂交模型 文库筛选的步骤 将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母 再将文库质粒转化到酵母中 通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白 序列分析 从酵母中分离质粒然后转化E. coli 从大肠杆菌中提取质粒并测序 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性 报告基因 LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media ADE2 reporter - Screen on Ade+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA) 质粒构建 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面的多克隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒 诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因，Leu2, Ura3, or Trp1等。 质粒样品 URA3 plasmid URA3 PCR product Li