中药对抑郁大鼠缺血-再灌注心肌细胞凋亡及survivin puma表达的影响-effects of traditional chinese medicine on apoptosis and survivin puma expression in ischemia - reperfusion myocytes of depressed rats.docxVIP

PAGE PAGE 3 1.实验动物 健康 SD 大鼠，体重 120±10g，由贵阳医学院动物实验中心提供。 2.主要器材： 培养箱 湿盒 微量移液器（2.5、10、200、1000μl） 德国 Eppendorf 公司 雪花制冰机（AF 100） 意大利 Scotsman 公司 光学显微镜 日本奥林巴斯公司 切片机 18cm 不锈钢高压锅和电炉 医用微波炉 水浴箱 超低温冰箱 美国 Thermo 公司 耐高温塑料切片架 定时器 pH 计 PCR 仪 Biometra,UNOⅡ 水平电泳槽， 北京君意东方仪器公司，JY-SPC； 电泳仪（TY200C） 北京君意仪器厂 电泳槽 北京君意仪器厂 高速离心机 SIGMA，1-13； 成像系统 柯达紫外显相系统 400W 像素 匀浆机（D－130） WIGGEN HAUSER 电子分析天平（AB104-N 型） 德国 Mettler Toledo 公司 台式高速冷冻离心机（5810R 型） 德国 Eppendorf 公司 台式低速离心机（80-2 型） 上海医疗器械有限公司 3.试剂： 2 1×TBS(20mM Tris pH7.6 140Mm NaCl) Calbiochem TdT- FragEL? DNA Fragmentation Detection Kit Cat.NO.QIA33 PBS(磷酸盐缓冲液 pH7.2-7.4) 柠檬酸盐缓冲液 CB（pH6.00，0.01mol/L1000m，配制柠檬酸三钠 3g：柠檬酸 0.4g） 迈新公司免疫组化试剂盒（KIT-5020，羊抗鼠/兔） Anti-Survivin antibody (ab24479) 稀释度：1:1000 Anti-PUMA antibody (ab9643) 稀释度：1:200 Trizol Reagent,Invitrogen Cat.NO.15596-026 ReverTra Ace-α-TM First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO #FSK-100 Taq DNA Polymerase (recombinant), Fermentas #EP0402 dNTP Mix （2mM each）, Fermentas #R0241 DNA Marker DL2，000， TaKaRa D501A 4、实验分组：： 40 只抑郁造模成功的 SD 随机分成 5 组: Dsham（抑郁大鼠假手术组）：在抑郁造模的第 22 天予以抑郁大鼠每天生理 盐水灌胃 1ml,共 7d,末次灌胃 1h 后行假手术 2.5h； DI/R（抑郁缺血-再灌注组）：抑郁造模的第 22 天予以抑郁大鼠每天生理盐 水灌胃 1ml,共 7d,末次灌胃 1h 后后行结扎左冠脉 0.5h,再灌注 2h； Escitalopram+DI/R（草酸艾司西酞普兰+抑郁缺血-再灌注组）：抑郁造模的 第 22 天予以抑郁大鼠草酸艾司西酞普兰（剂量为 0.9mg**kg-1*d-1）灌胃，共 7d, 末次灌胃 1h 后后行结扎左冠脉 0.5h,再灌注 2h； NXT+DI/R（脑心通胶囊+抑郁缺血-再灌注组）：抑郁造模的第 22 天予以抑郁 大鼠脑心通（剂量为 450mg**kg-1*d-1 灌胃），共 7d,末次灌胃 1h 后后行结扎左冠 脉 0.5h,再灌注 2h； DSDW+ DI/R（复方丹参滴丸+抑郁缺血-再灌注组）：抑郁造模的第 22 天予以 抑郁大鼠复方丹参滴丸（剂量为 75mg**kg-1*d-1）灌胃，共 7d,末次灌胃 1h 后后 行结扎左冠脉 0.5h,再灌注 2h。 注：所有药物剂量采用体表面积换算法。 5.抑郁大鼠模型的制备 方法：由于慢性不可预计温和应激抑郁模型（CUMS）较其他抑郁模型具有稳 定性高和可靠性好，且能够相对能较为真实的模拟人类抑郁症的形成等优点，故 本研究课题采用此模型。 步骤： 1）对所有 SD 大鼠行心电图检查； 2）对心电图无明显异常的 SD 大鼠行体重测量，旷置实验评分，1%蔗糖水偏 好实验(1% sucrose preference test）后，随机选取 40 只重 100-130g 的非抑 郁 DD 大鼠；剔除旷置实验评分（垂直+水平）小于 30 分或大于 120 分的大鼠； 3）选取下列应激源：摇晃 5min，置于潮湿笼子 17 小时，倾斜 17 小时，禁 食 24 小时，禁水 16 小时加空瓶刺激 1 小时，昼夜颠倒，夹尾 1min，冷刺激（4 摄氏度，5min），热刺激（40 摄氏度，5min）随机将上述应激源安排于一周内， 每日两种，连续 4 周。 4)对大鼠行体重测量，旷置实验评分，1%蔗糖水偏好实验，以确定 CUMS 模 型成功。 6.抑郁