猪链球菌噬菌体smp裂解酶和受体分析-analysis of smp lyase and receptor of streptococcus suis phage.docx

第四章 裂解酶 LySMP 功能区的生物学特性 69 1 材料与方法 71 2 结果 72 3 讨论 77 第五章 裂解酶 LySMP 对斑马鱼的猪链球菌抗感染试验 82 1 材料与方法 84 2 结果 87 3 讨论 90 第六章 噬菌体 SMP 的细菌受体分析 93 1 材料与方法 96 2 结果 98 3 讨论 101 全文总结 105 附录 1 溶液配制 106 附录 2 符号说明……………………………………………………………….……….109 攻读博士学位期间科研成果…………………………………………………………...110 致谢……………………………………………………………………………………...111 I I 猪链球菌噬菌体 SMP 裂解酶和受体研究 摘 要 猪链球菌病是一种重要的人兽共患传染病，能导致仔猪脑膜炎、败 血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎，对公共卫生尤其是相应 从业人员的生命安全构成威胁。因抗生素滥用，导致细菌耐药，给该病 的防控带来了困难。由噬菌体基因编码的裂解酶——裂解效率高、与抗 生素具协同作用，且不易产生抗性菌株，是一种颇具潜力的杀菌制剂。 本文通过重组表达的方法获得纯化的猪链球菌噬菌体裂解酶 LySMP，研 究了该酶的杀菌作用特点、酶不同结构区域 Lys1、Lys2、Lys3 和 Lys4 的杀菌活性以及应用裂解酶全酶治疗感染猪链球菌的斑马鱼的保护作 用。 为了获得具有生物学活性的猪链球菌噬菌体裂解酶LySMP，采用重 组表达技术，PCR扩增噬菌体SMP的裂解酶基因，插入pET-28a(+)中，构 建出重组表达载体pET-lys。将该载体导入大肠杆菌BL21中诱导表达，获 得55kDa的融合LySMP蛋白。酶谱试验表明该蛋白具有裂解宿主菌SS2-H 的活性。表达产物经纯化后，浓度可达1-3mg/ml。 裂解酶LySMP的体外生物学活性的研究发现纯化的LySMP需加 0.8% β-巯基乙醇方可发挥裂解作用。同时，细菌用PMSF和溶菌酶处理 II II 后也具有更好的裂解效果。平板裂解试验结果显示，LySMP的超声破碎 粗提物裂解谱比原始噬菌体广。噬菌体的宿主菌仅有2株猪链球菌2型， 但在17株猪链球菌2型中，有15株可被裂解酶裂解，此外，所测的猪链球 菌7型、9型，马兽疫链球菌亚种以及金黄色葡萄球菌，也可被裂解，不 过目前尚未发现其可裂解大肠杆菌和沙门氏菌。LySMP在37℃，pH5.2 的条件下，裂解效率最高。LySMP可使所测细菌浊度下降约1.2-98%不等。 为了进一步研究LySMP发挥裂解功能的区域，并比较各功能区与全 酶的裂解效率，同样通过大肠杆菌原核表达技术，针对全酶LySMP上的 催化区和结合区，进行了四种不同组合的区域表达。各片段位于LySMP 1-243、1-279、2-300和151-443位氨基酸，表达产物命名为Ly1, Lys2，Lys3， Lys4。表达后产物大小分别为32kDa、36kDa、39kDa和37kDa。酶谱试验 显示，Lys1和Lys2蛋白具有裂解宿主菌SS2-H的活性。而Lys3和Lys4未形 成可见的透明条带。表达产物Lys1, Lys2经纯化后，浓度可达1-3mg/ml。 对有较强裂解活性的区段Lys1和Lys2进行了体外生物学活性测定和 条件优化。超声波处理的Lys1, Lys2粗提物的裂解谱均比原始噬菌体广， 但比全酶LySMP的裂解谱窄。在17株猪链球菌2型中，7株可被Lys1和Lys2 分别裂解，金黄色葡萄球菌也可被裂解，形成透明的抑菌圈。7型菌株、 9型菌株、马兽疫链球菌亚种、大肠杆菌和沙门氏菌均不被裂解，不形成 抑菌圈。Lys1中加入0.3%β-巯基乙醇或加入20mM半胱氨酸后酶活性最 高；而Lys2中则需加入0.8% β-巯基乙醇或加入15mM半胱氨酸方可使酶 PAGE PAGE IV 活性达到最高。Lys1和Lys2的最佳作用温度均为37℃，Lys1和Lys2分别 在pH5.2和pH 6.8的条件下裂解效率最高。浓度均为100mM的Lys1、Lys2 和LySMP对SS2-4菌株的裂解试验结果显示，LySMP使细菌浊度下降最 多，达到33.7%；其次是Lys2，下降27.2%；Lys1最低，只有8.9%。 为了研究裂解酶的体内抗菌效果，选用裂解活性较强的LySMP，以 斑马鱼作为模式动物，统计裂解酶处理组和细菌攻击对照组斑马鱼的存 活率，从而揭示裂解酶的体内抗感染效果。试验研究了LySMP在不同感 染阶段对猪链球菌HA9801的抗感染效果。将斑马鱼分为7组，每组30尾。 裂解酶处理组1为在50LD50猪链球菌H