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特定蛋白的免疫测定及临床意义 卫生部临床检验中心 李金明 * 特定蛋白的免疫测定方法 基本原理：免疫沉淀反应 免疫透射比浊 免疫散射比浊 * 免疫沉淀反应的发展历史 1897年，Kraus发现细菌培养液与其相应抗血清混合后出现肉眼可见的沉淀反应 1902年Ascoli建立了环状沉淀试验。 1905年Bechhold将抗体混溶在明胶中，然后再将相应特异抗原加于其上，抗原抗体的特异结合可在明胶中出现沉淀。 1946年Oudin报道了试管单向免疫扩散试验。（ 1965年Mancini又提出了平板单向免疫扩散试验。） Grabar和Williams在1953年报道了免疫电泳。（对流免疫电泳、火箭免疫电泳和免疫固定电泳） 上述为经典免疫沉淀试验发展阶段，测定范围窄（10 ~ 100 μg/ml）、灵敏度低，繁琐费时，不能自动化。 * 免疫沉淀反应的发展历史 1959年，Schultze等报道了透射比浊法（Transmission turbidimetry)。 1967年，Ritchie等报道了散射比浊法(nephelometry)。 1977年，Sternberg等进一步发展建立了速率散射比浊法(Rate nephelometry)。 免疫比浊测定方法与免疫沉淀方法相比，灵敏度高，重复性好，测定范围宽，已用于临床体液特定蛋白含量的测定，现已有多种自动化检测仪器应用于临床检验，尤其是免疫散射比浊测定。 * 免疫透射比浊 基本原理：一定波长光线通过抗原抗体反应混合液时，被其中的免疫复合物（IC）反射或遮挡、吸收而减弱。在一定范围内，透射光被吸收的量与免疫复合物的量呈正比，后者又与相应抗原和抗体的量呈函数关系。抗体量一定，即可从标准曲线获知抗原的量。 由于要求抗原抗体复合物的数量足够，并且颗粒要足够大（35~100nm），本法的测定灵敏度和准确度相对较低。 * 免疫散射比浊 基本原理：光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光。根据雷利散射公式，在一定条件下，透射光与微粒浓度成反比，散射光与微粒浓度成正比。 散射比浊可分为终点和速率散射比浊两种。 光源 荧光：高压汞灯发射，入射光波长（?）355nm，散射夹角（?）为90℃ 激光：氦氖灯，?=663nm，?=15~35℃ 碘钨光：碘钨灯，?=400~500nm，?=70℃ * 影响免疫比浊测定的主要因素 抗原、抗体比例与浊度关系：抗原过量，出现“带现象”，IC分子小，且可发生再解离，浊度下降，光散射减少。抗体过量，IC形成随抗原量增加到抗原抗体最适比例时达高峰。抗体须过量但又必须适量，抗体浓度是测定关键。 * 影响免疫比浊测定的主要因素 抗体质量：特异性、效价、亲和力、R型抗体 高亲和性抗体的抗原结合点与抗原表位的空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离。反之，低亲和性抗体与抗原形成的复合物较易解离。 R型抗体以家兔免疫血清为代表，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，只在抗原过量时，才易出现溶性免疫复合物，大多数动物的免疫血均属此型。H型抗体以马免疫血清为代表，其抗原与抗体的合适比例范围较窄，抗原或抗体过量，均可形成可溶性免疫复合物。人和许多大动物的抗血清皆属H型。 * 影响免疫比浊测定的主要因素 反应溶液：pH6.5~8.5，适当浓度电解质（中和抗原抗体复合物表面电荷，促进凝聚）、离子强度（大，IC形成快）；一般常用磷酸盐缓冲液。 增浊剂：非离子型亲水剂如聚乙二醇（PEG）、吐温-20等，以PEG6000最好，浓度一般为3%~4%。浓度过高可致非特异沉淀。 * 特定蛋白测定的质量控制 室内质量控制 室间质量评价 * 特定蛋白测定的临床意义 血液中含有多种功能蛋白，如载体蛋白、免疫球蛋白（抗体）、酶、凝血因子等，其含量变化通常与多种疾病有密切关系。 C反应蛋白 (CRP) 、免疫球蛋白及亚类、补体C3和C4、抗链球溶血素O (ASO) 、类风湿因子 (RF)、前白蛋白 (Prealbumin) 、白蛋白 (Albumin) 、微白蛋白 (Microalbumin) β2微球蛋白(β2Microglobulin) 、 α1抗胰蛋白酶 (α1AT) 、铜蓝蛋白 (Caeruloplasmin) 、结合珠蛋白 (Haptoglobin) 、转铁蛋白 (Transferrin) 、载脂蛋白A （APO-A1） 、载脂蛋白B （APO-B）等。 * C反应蛋白 (CRP) 是一种由肝细胞合成的急性时相反应蛋白，是在炎症和组织坏死疾病的急性期出现于病人血清中的一种糖蛋白，它能与肺炎双球菌的荚膜成分C-多糖蛋白质起反应，故称为C-反应蛋白。具有激活补体和促进粒细胞及巨噬细胞吞