水产品中多种病毒的快速检测 反转录-环介导等温扩增法 征求意见稿.docVIP

SN/T ××××—×××× PAGE PAGE 1 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布XXXX-XX-XX实施XXXX- 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局发布 XXXX-XX-XX实施 XXXX-XX-XX发布 水产品中诺如病毒和星状病毒的快速检测 反转录-环介导恒温核酸扩增（RT-LAMP）法 Rapid detection of norovirus and astrovirus in aquatic product - reverse transcription - loop-mediated isothermal amplification method （征求意见稿） SN/T XXXX—XXXX SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 ICS 备案号： SN/T ××××.11—×××× PAGE I 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009要求起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出。 本标准由全国进出口食品检测标准化技术委员会（SAC/TC445）归口。 本标准起草单位：北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：魏海燕、曾静 。 PAGE 8 水产品中诺如病毒和星状病毒的快速检测 反转录-环介导恒温核酸扩增（RT-LAMP）法 范围 本标准规定了水产中诺如病毒和星状病毒的反转录-环介导恒温核酸扩增（RT-LAMP）快速检测法。 本标准适用于水产品中诺如病毒和星状病毒的快速检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本使用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1193 基因分析检测实验室技术要求 SN/T 1635 贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法 SN/T 2519 贝类中星状病毒检测方法 普通PCR和实时荧光PCR方法 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 Betaine：甜菜碱。 Bst酶：Bst DNA polymerase (large fragment)，Bst DNA聚合酶（大片段）。 dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。 LAMP：loop-mediated isothermal amplification，环介导恒温扩增。 RNA：Ribonucleic acid，核糖核酸。 技术概要 选取病毒基因的高度保守序列，设计5~6条RT-LAMP引物，特异性识别靶序列上的7~8个独立区域，在反应体系中加入具有链置换作用的Bst酶、AMV反转录酶，于等温条件（63 ℃左右）保温几十分钟，即可一步实现RNA的高效扩增。反应过程中 试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 引物 RT-LAMP扩增引物序列见表1，引物设计示意图见附录A。 表1 RT-LAMP扩增引物 病毒名称 引物名称 序列（5’-3’ 星状病毒 外侧上游引物（Ast-F3） GCAGGTAACTGTTGAGGTCA 外侧下游引物（Ast-B3） GGTTTTGGTCCTGTGACACC 内侧上游引物（Ast-FIP） CTGCTCTGTCCCGCCCTCTAATGGCCGCAACAGGAGTA 内侧下游引物（Ast-BIP） AGGACTAGAAGACAGCCCGGATGACAATGTTACGGACACGT 环状上游引物（Ast-LF） TTGTGAGCGGGCCCTTG 环状下游引物（Ast-LB） CGCGGCAAACATCAATCTTCTCA GI型诺如病毒 外侧上游引物（GI-F3） TCTACATTCCTGGGTGGCA 外侧下游引物（GI-B3） CCCAGCTACTGGTTCCATTG 内侧上游引物（GI-FIP） AGGAGATCGCGATCCCCTGTCCCATGTTCCGCTGGATGC 内侧下游引物（GI-BIP） GCGTCTAAGGACGCCCCAACGGCTCAGCTGTATTTGCCT 环状上游引物（GI-LF） ACATGCTCAGATCATGGAAGC GII型诺如病毒 外侧上游引物（GII-F3） GCCCCAACCATGAAGACC 外侧下游引物（GII-B3） ACGTGCTCAGATCCGAGAA 内侧上游引物（GII-FIP） GAATGCTGGGCCGTGGAGTGTGATACCACACTCCCAGAGG 内侧下游引物（G