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芒果UFGT基因克隆及表达分析 　　摘要：花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径，类黄酮糖基转移酶（UFGT）是花色素苷合成的最后一个酶，它可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。根据已经报道的UFGT基因的序列设计兼并引物，采用3′RACE、5′RACE方法，克隆得到芒果果实UFGT基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框为1 392 bp，编码463个氨基酸，分子量为51.15 ku。对基因组扩增得到2 770 bp长度的片段分析发现，该基因含有2个内含子，分别在501～1 095 bp、1 548～2 330 bp。通过系统发育分析发现，该基因编码的蛋白与荔枝、山竹子等热带果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的UFGT基因表达进行分析发现，红色的芒果品种中表达量较高，黄色的芒果品种中表达量较低。 　　关键词：芒果；花色素苷；UFGT基因；基因克隆 　　中图分类号： S667.701；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0031-03 　　芒果（Mangifera indica）是重要的热带、亚热带果树，其果实颜色多样[1]。芒果果实富含类胡萝卜素、花色素苷等物质，其中花色素苷合成途径是红色芒果果实着色的主要代谢途径。类黄酮糖基转移酶（UFGT）是花色素苷合成的最后一个酶，可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。卢其能等[1]、刘海峰等[2]分别从红巴梨果皮、马铃薯以及山葡萄中克隆了UFGT 基因，并且作了表达分析，到目前为止，山竹子（Garcinia mangostana）、草莓（Fragaria×ananassa）、西洋梨（Pyrus communis）、葡萄柚（Citrus×paradisi）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）等果树中的UFGT基因得到了克隆[3-6]。UFGT是花色素苷合成的关键基因。Ju等发现，苹果果实发育过程中，UFGT只在果实接近成熟的转色期表达，表达的强度与花色素苷合成呈正相关[7]。Boss等对白皮葡萄、黑皮葡萄的不同组织进行表达分析发现，UFGT基因只在有色的葡萄果皮中表达[4]。本研究采用RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个UFGT基因，探讨该基因在芒果果实花色素苷合成的作用机制及其对果实着色的影响，深入揭示该基因在芒果果实花色素苷生物合成的分子机制，旨在为芒果果实着色提供理论依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　以贵妃芒果的果实（取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部芒果种质资源圃）为试材。大肠杆菌DH5а为本实验室保存，引物合成自英骏生物技术有限公司，DEPC、IPTG、Tryptone、Yeast extract、Amp、X-GaL、pMD-19T载体、Taq DNA 聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶均购于大连宝生物公司。 　　1.2方法 　　参照王家保等所述的方法[5]提取芒果DNA，用无菌的双蒸水溶解，采用核酸蛋白测定仪进行测定，-20 ℃保存备用。采用天根总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取芒果总RNA，用RNase-free无菌水溶解，用大连宝生物公司的DNase试剂盒进行DNA去除，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和DNA是否去除干净，并用核酸蛋白测定仪对所得RNA的D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm及浓度进行测定，用TaKaRa公司的3′和5′-RACE 试剂盒进行目的基因的3′、5′转录。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；95 ℃变性50 s，50 ℃复性50 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸7 min；反应体系为25 μL，其中含10×PCR buffer （含Mg2+） 2.5 μL、25 ng/μL DNA模板2.0 μL、20 μmol引物各1.0 μL、2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL、5.0 mmol/L dNTPs 2.0 μL；反应体系在eppendor PCR仪上扩增，扩增反应结束后取10 μL进行扩增产物的电泳，采用gelred染色后在紫外凝胶成像仪上观察、拍照分析。 　　1.3UFGT基因全长cDNA和基因组DNA序列的获得 　　以贵妃芒果的果实总RNA作为模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）反转录合成第一链cDNA，并参照该试剂盒的说明书进行cDNA 3′ 端和5′末端cDNA的扩增。根据cDNA片段的测序结果，分别设计2条上游引物，以接头为锚定引物进行半巢式PCR反应。将3′ 端和5′末端的PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，确定所得到