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Laboratory Methods for the Diagnosis of Mycobacterium 分枝杆菌的实验室诊断 高雄荣总 病理检验部 微生物科 窦慧琴 99.10.19 实验室诊断方法 课程目标 (1) 了解结核菌的培养检体收集的方法 检体收集的容器 检体的前处理 接种的培养基 了解抗酸性染色、 原理及判读标准 了解MTB的鉴定方法 认识自动化培养仪器(MGIT 960) 鉴定仪器(ProbeTec)原理及操作方法 TiBilia test 课程目标 (2) 了解NTM的鉴定方法 PCR-PFLP Method 了解分子生物学鉴定方法-PCR restriction-enzyme analysis (PRA)之原理、操作、及结果判读 Biochemistry reactions method 了解药敏试验的方法及使用的药物 General Characteristics GPB: 0.2-0.4x2-10 um Strictly aerobic 5-10% CO2 enhance growth High lipids in cell wall Mycolic acid Long chain fatty acid ( cell wall 60%) Hydrophobic Acid fastness Resist acid and alkali 结核菌的培养 检体收集的方法 检体收集的容器 检体的前处理 接种的培养基 检体采集 采集时间 Sputum 以清晨第一口痰为佳(3-5mL) Gastric lavage 15 mL 清晨抽取 分枝杆菌检体收集容器 50cc 蓝头离心管 Sputum 5cc Gastric lavage 15cc 胃液用的容器需加入Na2CO3可中和胃酸 Urine 40cc Tissue, pus Stool 5cc 15cc 绿头离心管 Body fluids 2cc Fungal medium Bone marrow/blood 检体收集容器：宽口, 螺旋盖, 防摔, 避免泄漏 检体处理 加等量的 6% NaOH-NALC-Sodium citrate化痰液 强力 Vortex 约 15 - 20 秒 挑取约 5 ml 痰液至 50 ml 离心试管 室温静置 20 分钟 加无菌 Phosphate Buffer 至约 45 ml, 盖紧盖子 离心 3,800 rpm 约 15 分钟( 4℃) 倒掉上清液, 留下 2 ml 接种: 取 0.5 ml 检体至 MGIT tube 0.1ml检体至LJ 培养基 同时做一片抹片染 Acid Fast Stain 接种的培养基 MGIT (Mycobacteris Growth Indicator Tube) Modified Middlebrook 7H9 Broth Ruthenium fluorescent complex MGIT OADC? Oleic Acid：供分枝杆菌生长时利用 Albumin：键结干扰分枝杆菌生长的游离脂肪酸 Dextrose：提供能量来源 Catalase：破坏具毒性的过氧化物 MGIT PANTA 抗菌剂及抗霉菌剂抑制非分枝杆菌生长 包含下列5种抗生素：Polymyxin B、Amphoterin B、Nalidixic acid、Trimethoprim、Azlocillin Lowenstein-Jensen slants Inoculation and Incubation MGIT 960 (Becton-Dickinson Diagnostic Instrument Systems) In the 35 ℃ incubator 0.5cc-culture for 6 weeks Lowenstein-Jensen slants In the 35 ℃ incubator 0.1cc-culture for 8 weeks. Identification BD ProbeTec ET system CTB assay Incubation Temperature Most: 35-37 ℃ Skin soft tissue: 25-30℃ M. marinum, M. haemophilae Blood Bone marrow: 36-38 ℃ Atmosphere Middlebrook agars: 5-10% CO2 L-J medium: only 7 days after inoculation BACTEC other commercially broth system: do not require inc
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